| 研究課題/領域番号 |
20K06925
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
伊藤 美佳子 名古屋大学, 医学系研究科, 特任講師 (60444402)
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| 研究分担者 |
大河原 美静 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (80589606)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 先天性筋無力症候群 / GFPT1 / DOK7 |
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| 研究実績の概要 |
先天性筋無力症候群 (CMS: congenital myasthenic syndromes,)は筋力低下や易疲労性を呈し、軽度から重度の呼吸困難、嚥下困難、四肢筋力低下が認められるが、その分子病態は十分解明されていない。CMSの中で、タンパクや脂質の糖化酵素であるGFPT1(Glutamine:Fructose-6-Phosphate Transaminase 1)の変異が原因分子の一つであり、肢帯型の筋力低下が特徴である。
我々はGFPT1遺伝子のc.252A>T と c.722^723insG のヘテロ変異を持つ患者を同定した。c.722^723insGはexon 9内の変異であり、reading frameを変えてpremature stop codonをexon10内に導く。この患者由来のiPS細胞を使用し、MyoD expression systemを用いて筋細胞に分化させ、100 mM GlcNAcを培地中に添加するとiMbsの分化効率は良くなった。また、GFPT1患者と同じ変異を有するモデルマウスを作成し、その運動能、病理像、形態観察を行い神経筋接合部の分子構築機構の解明を行った。
さらに、本邦の肢帯型CMS患者においてDok-7上に複合ヘテロミスセンス変異(c.653-1G>C; c.190G>A)を同定した。患者iPSC細胞を用いて、c.653-1G>Cはスプライシングパターンが変わることを発見した。exon6のスキッピングにより、nuclear export signal (NES) が欠損したDOK7が作られる。c.190G>Aはpleckstrin homology domain (PH domain)上にあり、アミノ酸が変化する。この変異は、MHC やCHRNG といった筋組織で発現する遺伝子群の発現を減少させることを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
GFPT1c.722^723insG変異のモデルとして、CRISPR/Cas9 systemを用いてc.716^717insG ノックインマウスを作製し、表現型解析を行った。運動試験の結果は、このマウスは若年齢ではコントロールと差がなかく、9ヶ月齢では筋力に低下が見られた。骨格筋におけるexon 9の欠失が神経筋接合部の形成にどのような影響があるかを調べるため、大腿四頭筋と腓腹筋の免疫組織染色を行い、神経末端（synaptophysin）とアセチルコリンクラスターを可視化した。若年齢ではコントロールと同様であったが、9ヶ月齢ではアセチルコリンクラスター面積の減少が見られた。マウスが9ヶ月例になるまで解析できないのは、時間がかかる原因になるが、今後は、神経筋接合部形成や筋肉代謝におけるGfpt1の役割を、神経筋接合部の表現型やUDP-GlcNAcの量から、さらに詳しく調査する。
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| 今後の研究の推進方策 |
骨格筋における患者GFPT1変異の神経筋接合部形成の影響を調べるため、大腿四頭筋と腓腹筋の免疫組織染色を行い、神経末端（synaptophysin）とアセチルコリンクラスターを可視化した。若年齢ではコントロールと同様であったが、9ヶ月齢ではアセチルコリンクラスター面積の減少と断片化が観察された。今後は、神経筋接合部形成や筋肉代謝におけるGFPT1の役割を、神経筋接合部の表現型やUDP-GlcNAcの量から、さらに詳しく調査する。
マウスはヒトと異なり、筋組織でGFPT2の発現が高く、GFPT1の機能を補助する役割がある。Gfpt1 c.716^717insGノックインマウスの表現系が顕著に出なかったのは、GFPT2がGFPT1の機能を補っているためと考えられる。そこで、GFPT2ノックアウトマウスを作製しており、現在c.722^723insGノックインマウスと掛け合わせを行っている。このマウスの作成には大変時間がかかると予想される。Gfpt1 c.716^717 insG, Gfpt2-/-マウスが作成でき次第、運動試験・行動量試験などの表現型の解析や、神経筋接合部特異的に発現している分子の変化を検出し、患者変異GFPT1において、異常を起こした分子メカニズムを詳細に解析する。また、UDP-GlcNAcの量から、神経筋接合部形成や筋肉代謝におけるGfpt1の役割をさらに詳しく調査する。
DOK7型CMS研究においては、DOK7 c.653-1G>C; c.190G>Aの変異が病因になるメカニズムをさらに詳しく調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マウスではGPT1の他にGFPT2が補助タンパクとして働いていることがわかり、GFPT1の変異だけでは患者と同じ症状を示さなかった。そのため、GFPT2ヘテロノックアウトマウスを作成し、変異GFPT1ノックインマウスとの掛け合わせを行い、ダブルノックイン、アウトマウスの作出を行なっている。その間、iPS細胞を用いたin vitroでの解析を行なっているが、マウスの解析実験は次年度に持ち越した。また、参加予定をしていた学会が全てオンライン開催になり、旅費が発生しなかった。
今年度の使用計画は、実験器具類、試薬類、共通機器使用料、学会が実地開催になれば旅費の予定である。
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