| 研究課題/領域番号 |
20K06925
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
伊藤 美佳子 名古屋大学, 医学系研究科, 講師 (60444402)
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| 研究分担者 |
大河原 美静 名古屋大学, 医学系研究科, 特任准教授 (80589606)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 先天性筋無力症候群 / GFPT1 |
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| 研究実績の概要 |
先天性筋無力症候群 (CMS: congenital myasthenic syndromes)は筋力低下や易疲労性を呈し、軽度から重度の呼吸困難、嚥下困難、四肢筋力低下が認められるが、その分子病態は十分解明されていない。CMSの中で、タンパク質や脂質の糖化酵素であるGFPT1(Glutamine:Fructose-6-Phosphate Transaminase 1)の変異が原因分子の一つであり、肢帯型の筋力低下が特徴である。GFPT1は、UDP-N-アセチルグルコサミンを合成するヘキソサミン生合成経路の律速酵素であり、UDP-GlcNAc）は、タンパク質および脂質のN結合型およびO結合型のグリコシル化の基質である。 GFPT1は多くの組織で至る所で発現している。骨格筋では、選択的スプライシングにより4ヌクレオチドのexon 9が含まれているGFPT1-L isoformが高発現しており、それは酵素活性が低く、この長いGFPT1-L isoformの役割は不明である。本研究ではhuman myoblast KD3/Hu5細胞を用いてこのisoformの生成には、スプライシングcis因子の破壊、RNA結合タンパクのartificial tethering、初期スプライセオソーム複合体の分離により、SRSF1 と Rbfox1/2 が協調的に増強し、hnRNP H/F がヒト GFPT1 exon 9 のリクルートメントを調節することにより、その包含を抑制することが明らかにした。また、骨格筋におけるGFPT1-Lバリアントの役割を調査するために、exon 9スキッピングマウスを作製し、その表現型を解析した。Gfpt1-L-/-マウスは若年では形態に変化が見られないが、高齢になるにつれて筋力低下が起きることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Gfpt1-L-/-マウスは、Gfpt1のexon 9を削除することにより、CRISPR / Casシステムを使用して、当施設の動物施設で作製した。骨格筋および心臓におけるexon 9のスキッピングは、RT-PCRによってホモ接合マウスで確認した。運動能を調べるために、加速ローターロッドテストでは、Gfpt1-L-/-マウスは、野生型マウスと比較して、12か月齢から筋持久力が20から30％低下することが明らかになった。 Gfpt1-L-/-マウスは、12か月齢で野生型マウスよりも体重増加を示した。骨格筋に GFPT1-L が存在しないため、GFPT1 と UDP-HexNAc の量がそれぞれ約 4.5 倍と約 2.8 倍に増加した。骨格筋のメタボロミクス分析により、Gfpt1-L-/-マウスのヘキソサミン生合成経路へ代謝物の増加が解糖経路を抑制し、ミトコンドリアの電子伝達系を強化する可能性が高いことを示された。高齢のGfpt1-L-/-マウスは、インスリンに応答してグルコース取り込み障害を示した。高齢のGfpt1-L-/-マウスは、筋力低下と疲労、小さく断片化されたアセチルコリン受容体クラスター、単純化されたシナプス後接合部ヒダを示した。これらは、GFPT1 変異による先天性筋無力症候群で観察されるものと同様であるがシビアではなかった。 一方、上腕三頭筋のRNA-seqデータでは、予想に反してGfpt1-L-/-マウスと野生型マウスの間に違いはなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までに得られたデータから、GFPT1-Lが骨格筋で欠損することで、神経筋接合部の構造異常を起こすことが判明し、シグナル伝達の障害が筋力低下の原因と考えられる。また、解糖系の代謝産物が減少しており、エネルギー産生の異常が推測される。
現在は患者変異と同じ、c.722^723insG変異のモデルとしてexon9をスキップさせた、exon10にstop codonを出現させたshort GFPT1を有するマウスを作製しており、このマウスの表現型解析を行っている。c.716^717insGマウスの骨格筋神経筋接合部は、AChRのクラスタリングの断片化が見られたため、電子顕微鏡を用いて、骨格筋の細部の観察を行う。また、c.716^717insGマウスは野生型より体重が重く、皮下脂肪が多いことから、CTスキャンによる内臓脂肪組織の測定を予定している。
マウスはヒトと異なり、筋組織でGFPT2の発現が高く、GFPT1の機能を補助する役割がある。GFPT1 c.722^723insGノックインマウスの表現系が顕著に出なかったのは、GFPT2がGFPT1の機能を補っているためと考えられる。そこで、GFPT2ノックアウトマウスにおいても作製しており、表現型解析を進めている。どちらも高齢になると表現型がみられるため、一定期間飼育後、運動試験及び糖鎖タンパク量の測定を行う。また、神経筋接合部特異的に発現している分子の変化を検出し、患者変異GFPT1において、異常を起こした分子メカニズムを詳細に解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マウスではGPT1の他にGFPT2が補助タンパクとして働いていることがわかり、GFPT1の変異だけでは患者と同じ症状を示さなかった。そのため、GFPT2ヘテロノックアウトマウスを作成し、変異GFPT1ノックインマウスとの掛け合わせを行い、ダブルノックイン、ノックアウトマウスを作出した。このマウスは高齢にならないと表現型が表れないことが分かり、マウスの匹数を増やして高齢になるのに時間がかかった。
また、COVID19の流行を鑑みて、実地参加した学会は名古屋開催の２つの学会のみにしたため旅費の支出が少なかった。
次年度の使用計画は、実験器具類、試薬類、共通機器使用料、学会の参加費並びに旅費の予定である。
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