オプトジェネティクスを用いた神経血管連関における微小血流調節機序と虚血時の反応性

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K06929
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 冨田 裕 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師(非常勤) (60276251)
• 研究分担者: 畝川 美悠紀 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 研究員 (10548481) ; 伊澤 良兼 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (90468471)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: オプトジェネティクス / 脳微小循環 / Neurovascular unit / 脳虚血 / 神経科学

研究実績の概要

脳内ではニューロン・グリア細胞・微小血管は神経血管連関（Neurovascular unit (NVU)）を形成し、相互に連絡を取り合っている。NVUを構成するニューロン、アストロサイト、血管平滑筋、ペリサイトなどの脳微小循環調節における役割を解明するため、オプトジェネティクス手法を用いてNVUを構成する特定の細胞種だけに光感受性膜タンパク質・チャネルロドプシン２(ChR2)を発現させたマウスを用い、非侵襲的に細胞特異的に光刺激を加えて脳微小循環における局所的な血管運動が脳微小血流の空間分布に与える影響を明らかにし、そのメカニズムをin vivoで詳細に検討する。ChR2をニューロンあるいはアストロサイトに発現させた遺伝子組み換えマウスをウレタンで麻酔し、波長488 nmのアルゴンレーザーまたは460 nmのLEDによって直径0.5 mmの範囲で頭蓋上に光照射することによって当該細胞のみを賦活化し、レーザースペックル血流計を用いて大脳半球表面の血流を連続的に記録した。ニューロン、アストロサイトの刺激によりいずれも光強度依存的に脳血流は増大し、照射部位より広範囲への伝播が認められた。一部の頭頂骨を除去して各種神経阻害薬を滴下、浸潤させることによる薬理学的手法を用いて、その機序が異なることを明らかにした。次に、二光子顕微鏡を用いて脳微小血管の挙動を検討した。脳血管の形態を観察するためスルホローダミン101を腹腔内投与し、水銀ランプ(波長470～490 nm)により脳表への光刺激を施し、脳表から深さ0-400 μmの範囲で脳表軟膜動脈および実質内穿通動脈の刺激前後の口径を解析した。アストロサイト刺激時は脳表から実質内動脈で一様に拡張したが、ニューロン刺激時には脳表動脈より実質内動脈で顕著な拡張反応を呈することが明らかになった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

緊急事態宣言による研究施設の閉鎖から一時的に実験を中断したが、得られたデータの精査、論文の作成、より深く掘り下げることによる実験計画の検討に当てられた。そのため、実験再開後は効率よく実験を行うことができた。

今後の研究の推進方策

ニューロンやアストロサイトのみならず、NVUを構成する各細胞種（血管平滑筋、ペリサイトなど）にChR2を発現したマウスを使用し、光照射による微小脳血流の経時的、空間的変化をレーザースペックル血流計で計測する。さらに、二光子顕微鏡で水銀ランプによる脳全域刺激あるいは二光子レーザーによる単一細胞刺激による動脈、細動脈、静脈、毛細血管の挙動および伝播を観察する。次に、当該マウスを用いて中大脳動脈閉塞術あるいは総頸動脈にマイクロコイルを装着することによる脳虚血・慢性低灌流等の病態モデルを作成し、血流調節機能が維持されているか否かを長期間反復して in vivo 解析するとともに、光刺激に対する反応性、慢性光刺激による影響を検討する。これらによって脳血流・脳機能を維持/向上するための方策を探求する。

次年度使用額が生じた理由

緊急事態宣言による研究施設の閉鎖により、一時的に実験を中断したことから、マウスの飼育費用が抑えられた。また、それまでの備蓄品で実験を行うことができたため、新たな消耗品の購入も少なかった。今後はマウスを用いた実験を進めると同時に、国内外の学会・論文発表に向けて学会参加、英文校正、投稿に要する費用などに対して使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Differential pial and penetrating arterial responses examined by optogenetic activation of astrocytes and neurons (2021)
  • 著者名/発表者名: Hatakeyama N., Unekawa M., Tomita Y. Suzuki N. Nakahara J. Takuwa H., Kanno I., Matsui K., Tanaka K.F., Masamoto K.
  • 雑誌名: J Cereb Blood Flo Metab 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1177/0271678X211010355
  • 査読あり
• [雑誌論文] High-Contrast In?Vivo Imaging of Tau Pathologies in Alzheimer’s and Non-Alzheimer’s Disease Tauopathies (2021)
  • 著者名/発表者名: Tagai K, Ono M, Kubota M, Kitamura S, Takahata K, Seki C, Takado Y, Shinotoh H, Sano Y, Yamamoto Y, Matsuoka K, Takuwa H, Shimojo M, Takahashi M, Kawamura K, Kikuchi T, Okada M, Akiyama H, Suzuki H, Onaya M, Takeda T, Arai K, Arai N, Araki N, Saito Y, Trojanowski JQ, Lee VMY, Mishra SK, Yamaguchi Y, Tomita Y, et al.
  • 雑誌名: Neuron 巻: 109 ページ: 42～58.e8
  • DOI: 10.1016/j.neuron.2020.09.042
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characteristics of cortical spreading depression and c-Fos expression in transgenic mice having a mutation associated with familial hemiplegic migraine 2 (2020)
  • 著者名/発表者名: Tang Chunhua、Unekawa Miyuki、Shibata Mamoru、Tomita Yutaka、Izawa Yoshikane、Sugimoto Hiroki、Ikeda Keiko、Kawakami Kiyoshi、Suzuki Norihiro、Nakahara Jin
  • 雑誌名: Cephalalgia 巻: 40 ページ: 1177～1190
  • DOI: 10.1177/0333102420929028
  • 査読あり
• [雑誌論文] Deschloroclozapine, a potent and selective chemogenetic actuator enables rapid neuronal and behavioral modulations in mice and monkeys (2020)
  • 著者名/発表者名: Nagai Y, Miyakawa N, Takuwa H, Hori Y, Oyama K, Ji B, Takahashi M, Huang XPi, Slocum ST, DiBerto J F, Xiong Y, Urushihata T, Hirabayashi T, Fujimoto A, Mimura K, English JG, Liu J, Inoue K, Kumata K, Seki C, Ono M, Shimojo M, Zhang MR, Tomita Y, et al.
  • 雑誌名: Nature Neuroscience 巻: 23 ページ: 1157～1167
  • DOI: 10.1038/s41593-020-0661-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Imaging of Cerebral Microcirculation and Expectations for Biomedical Engineering (2021)
  • 著者名/発表者名: Tomita Y., Unekawa M., Izawa Y., Masamoto K., Kanno I., Nakahara J.
  • 学会等名: 第46回日本微小循環学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] Manipulation of cerebral microcirculation flow via photo-stimulation to vascular mural cells with optogenetics. (2021)
  • 著者名/発表者名: Murata J., Oishi M., Unekawa M., Kanno I., Tomita Y., Tanaka K., Nakahara J., Masamoto K.
  • 学会等名: 第46回日本微小循環学会総会
• [学会発表] 光を用いた脳微小循環動態のイメージングと操作 (2021)
  • 著者名/発表者名: 正本和人, 村田樹里, 畝川美悠紀, 冨田裕, 菅野巖.
  • 学会等名: 第37回スパズム・シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] Imaging of water kinetics during cytotoxic edema using indirect MRI with O17-labeled water. (2021)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa T., Hoshino Y., Kameda H., Komaki Y., Unekawa M., Tomita Y., Nakahara J., Kudo K., Yasui M.
  • 学会等名: 第94回日本薬理学会年会
• [学会発表] Analysis of red blood cell velocity in intraparenchymal capillaries and arterial diameter in mice. (2020)
  • 著者名/発表者名: 冨田裕, 畝川美悠紀, 伊澤良兼, 正本和人, 菅野巌, 中原仁.
  • 学会等名: 第61回日本神経学会学術大会
• [学会発表] アクアポリン４は水中毒によるparavascular spaceの閉塞と脳神経活動の低下を促進する (2020)
  • 著者名/発表者名: 石川智愛, 畝川美悠紀, 冨田裕, 中原仁, 安井正人.
  • 学会等名: 第93回日本薬理学会年会
• [学会発表] 生体脳イメージングによる病原性蛋白質の脳外排出メカニズムの解明 (2020)
  • 著者名/発表者名: 高橋真奈美, 田桑弘之, 漆畑拓弥, 下條雅文, 冨田裕, 中原仁, 佐原成彦, 樋口真人.
  • 学会等名: 第63回日本脳循環代謝学会学術集会
• [学会発表] Dynamic response of arterial diameter and red blood cell velocity in capillaries associated with cortical spreading depolarization/depression (2020)
  • 著者名/発表者名: Tang C., Unekawa M., Tomita Y., Masamoto K., Kanno I., Nakahara J.
  • 学会等名: 第45回日本微小循環学会総会
• [学会発表] Optogenetic manipulation of cerebral microcirculation by transcranial photostimulation to the channelrhodopsin-2 expressing mouse brains. (2020)
  • 著者名/発表者名: Murata J., Unekawa M., Kanno I., Tomita Y., Tanaka K., Nakahara J., Masamoto K.
  • 学会等名: 第45回日本微小循環学会総会