| 研究課題/領域番号 |
20K06970
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
石山 亜紀 北里大学, 感染制御科学府, 助教 (70300746)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | pfeIF4A / 原虫感染症 / マラリア原虫 / Target protein fishing / リーシュマニア原虫 |
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| 研究実績の概要 |
抗マラリア薬探索の過程で慢性骨髄性白血病治療薬として用いられているBcr-Ablチロシンキナーゼ阻害薬のnilotinibに抗マラリア原虫活性を示すことが見出された(J. Antibiot., 2014 )。一方で、マラリア原虫にはチロシンキナーゼが存在せず、nilotinib は新たな作用メカニズムで抗マラリア原虫活性を示すと期待される。抗マラリア作用標的を明らかとすることで新たな創薬ターゲットを開拓し薬剤創出のためのスクリーニングへ応用することを目的とし研究を進めている。
マラリア原虫の細胞質画分を用いたtarget protein fishingによってnilotinib結合タンパク質pfeIF4Aが見出され、検証を進めるために組み換えHis-tagged pfeIF4Aの取得(大腸菌発現系)を行った。検証に至るまでのHis-tagged pfeIF4Aの取得が出来ず、その生産量も少ない。またHis-tagged pfeIF4Aの発現にも再現が見られなくなったため、種々大腸菌を用いて検討し、Stratagene より入手した大腸菌：BL21(DE3)[pLysS]を用いることでタンパクの発現が再現された。培養条件検討した培養菌体は-80℃で保存しており、順次発現の確認、精製を行い、発現条件を統一しながらタンパク質を確保していく。
大腸菌発現系に加え、より効率の良いタンパク発現と取得を目的として無細胞タンパク質発現系によるHis-tagged pfeIF4A取得の検討を行った。翻訳後反応液のHis-tagged 検出では陽性であったが、SDS-PAGEでは目的の大きさと異なるものであった。反応系中の翻訳因子と発現したHis-tagged pfeIF4Aが翻訳因子複合体として会合して異なる大きさで検出された可能性も考えられ、ウエスタンブロットで確認する必要がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
マラリア原虫の細胞質画分を用いたtarget protein fishingによってnilotinib結合タンパク質pfeIF4Aが見出され、検証を進めるために組み換えHis-tagged pfeIF4Aの取得(pET system)を行ったが、His-tagged pfeIF4Aの発現に再現性が見られなくなった。大腸菌発現系での検討、及び細胞タンパク質発現系による検討などを重ねることとなり、検証までに至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. -80℃保存の培養菌体(pfeIF4A発現)を用いて順次精製を行い、発現量などの確認から培養条件を決定する。
2. 培養物からpfeIF4Aを確保し、pfeIF4Aとnilotinibとの相互作用を確認する。
3. pfeIF4A特異的な阻害剤を見出すための評価系構築を目指す。
4. 無細胞タンパク質発現系によるHis-tagged pfeIF4Aのウエスタンブロットによる確認を行い、大腸菌発現系を用いた場合との効率差を確認する。
5. Target protein fishingにより取得したnilotinib結合タンパク質にはVoltage-dependent anion-selective channel protein, putative (PF3D7_1432100)も含まれ、これについてゲノム編集技術を適応した解析を行い創薬標的としての可能性を探る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
設備費に変わり、研究が遅延した部分の再検討に消耗品として充当させて頂いたため、使用差額が生じた。今年度は研究を進めるための消耗品、成果発表のための旅費などに充当する予定。また、必要に応じて設備備品の購入を行う。
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