精密医療における修飾核酸プロファイリング法の開発

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K06997
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 松本 洋太郎 東北大学, 薬学研究科, 講師 (90420041)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 修飾核酸 / 修飾ヌクレオシド / LC-MS/MS / プロファイリング / 安定同位体 / 一斉定量

研究実績の概要

修飾核酸は、RNAの構成成分であるリボヌクレオシドにメチル化などの転写後修飾が加わったもので、150種類以上知られている。修飾核酸の発生は成長や生体の環境変化に伴うと予想されており、酸化ストレスや様々な疾患と修飾核酸についての報告がなされている。このことは、血中修飾核酸量の変動が生体の様子を反映している可能性を示す。また、RNA上で発現した修飾核酸は代謝によりモノヌクレオシド化されて血中へと放出されていく。つまり、生体中の修飾核酸量の把握、修飾核酸プロファイル解析が疾患および病態解明につながるものと考えられる。
私は修飾核酸プロファイルによる新たな疾患診断法の開発を目指しており、生体内の修飾核酸量の同時分析手法が本研究において必須と考える。所属研究室が以前報告したLC-MS/MSによる修飾核酸一斉分析法では多くの修飾核酸を良好に分離できるが、生体試料に適用した際に生体マトリックスの影響によって一部の化合物で安定に定量出来ない問題があった。この問題を解決するため、内標準物質として安定同位体を用いることとした。さらには測定対象項目の追加を行い、修飾核酸分析手法の確立を直近の目的とした。
まず、入手困難な修飾核酸標品、および安定同位体について有機合成を行った。次に、これらの化合物を用いて修飾核酸一斉定量系を構築した。その結果、安定同位体を内標準物質として使用することで直線性の高い検量線を作成することができた。また、ヒトプール血漿で添加回収試験を行い、構築した分析系が19種の修飾核酸量を高精度に評価できることを示した。
構築した分析系は、生体内に存在する様々な修飾核酸量を高精度に評価できることがわかった。今後は本測定系を用いて様々な疾患の診断法への応用を進めていく予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

初年度と次年度の2年間は修飾核酸の合成、次年度に分析法開発を計画しており、予定通り進んでいる。
入手困難な安定同位体について有機合成を行い、修飾核酸は9種(D, m3U, Am, m1I, m7I, ac4C, m1G, g6A, t6A)、安定同位体については17種(C-d2, D-d4, Cm-d3, m3C-d3, m5C-d3, m3U-d3, m5U-d3, Am-d3, m1I-d3, m7I-d3, ac4C-d3, m1G-d3, m2G-d3, m7G-d3, m22G-d6, g6A-13C2,15N, t6A-13C4,15N)、すべてにおいてNMR、HRMSにて化合物同定を行い、単一化合物であることを確認した。
また次年度へ向けた予備検討として、合成化合物および購入できた標品等を用いてMS検出条件ならびにLC分離条件の最適化、測定対象とした24種の修飾核酸について検量線を作成した。各修飾核酸の検量線は良好な直線性を示した。また、本定量系のヒト血漿中における測定再現性を確認するため、添加回収試験を実施し、修飾ヌクレオシド19種がバリデーションガイドライン要件を満たした。
以上の状況を踏まえ、次年度は残りの修飾核酸の合成を行い、一斉分析法を構築する予定である。

今後の研究の推進方策

次年度に予定していた分離分析条件の検討は初年度に並行して進めていたため、安定同位体が合成・精製出来次第、検量線の作成や分析バリデーションを行う準備が出来ている。当初の計画通り次年度も引き続き合成を行い、 修飾核酸一斉定量法の確立を行う。
分析法の予備検討で解決すべき課題を抽出した。一部の修飾核酸については検量線濃度範囲が血漿中濃度をカバーできなかった。血漿中マトリックスによる検出妨害が考えられ、前処理の検討、SRM条件の見直し等で改善出来る可能性がある。5種の修飾核酸については添加回収試験において条件を満たせず、今後の検討課題となった。この対処として、純度の高い安定同位体の純度向上、あるいはグラジエント等を変更し、マトリックス効果の抑制が必要と考えられる。

次年度使用額が生じた理由

学会等の出張旅費の支出が無かったため、次年度使用額が生じた。
翌年度分としては物品費（分析実験の消耗品等）で使用する計画である。