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2023 年度 実施状況報告書

超耐熱化蛋白質融合抗体フラグメントの創製

研究課題

研究課題/領域番号 20K07008
研究機関崇城大学

研究代表者

大栗 誉敏  崇城大学, 薬学部, 教授 (70346807)

研究分担者 安楽 誠  崇城大学, 薬学部, 教授 (60398245)
研究期間 (年度) 2020-04-01 – 2025-03-31
キーワード抗体エンジニアリング / Pichia pastoris / アダリムマブ / タンパク質の安定化 / 融合タンパク質
研究実績の概要

抗体エンジニアリングの発展により、多くの抗体フラグメントが開発されている。Fv領域は抗原結合を担う必須のドメインであるが、単独では安定性に問題がある。そこで本研究では、熱安定性の高いタンパク質をFvへ融合させ、安定性の高い抗体フラグメントを作製することを目的としている。これまでに抗体医薬品アダリムマブのFv領域に、安定性が著しく上昇した二量体phlp7の分子間SS結合導入変異体を融合させた分子の発現系を構築し、酵母による調製を行ってきた。その結果、VHとVLからなる二量体タンパク質の調製に成功した。しかし融合しているphlp7の分子間SS結合の形成は確認出来ていなかった。2022年度はFvとphlp7をつなぐリンカーやFvのC末端アミノ酸の長さを変えた融合体など計10個の融合体を作製し、酵母より生産し調べたが、分子間SS結合形成は見られなかった。Phlp7はドメインスワッピングによる二量体構造を形成しており、単量体構造も形成することが報告されている。そこで2023年度では、phlp7の分子間SS結合が形成されないのは、phlp7が単量体構造を形成している事を考え、単量体形成を抑制する変異体の作製をおこない、単量体構造に必要なターン構造を抑制するためターン構造の出現頻度の低いVal残基の導入を試みた。これまで作製した数種の変異体のターン領域へVal-Val配列(G33V+S34V)を変異導入した結果、一部で分子間SS結合によるphlp7の二量体形成が初めて確認された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2023年度は、これまで作製した変異体の数種に対し、phlp7の単量体形成を抑制し、二量体形成を促すVal-Val配列の変異を導入した結果、一部ではあるが、初めてphlp7部位の分子間SS結合による二量体形成が確認されたため。

今後の研究の推進方策

Fv融合体の土台となるphlp7の分子間SS結合を形成させることが課題であったが、phlp7の単量体形成を抑制し、二量体形成を促すVal-Val配列の変異導入が有効であることを見出した。引き続き、リンカーアミノ酸の種類、長さ、リンカー接合部位を検討しつつ、Val-Val配列の変異を導入し、目的の融合タンパク質の作製を試みる。作製に成功した融合体については、熱安定性、結合活性を詳細に解析する。

次年度使用額が生じた理由

新型コロナ感染症の影響が響き、実験が予定より遅延しているため。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Stabilization of adalimumab Fab through the introduction of disulfide bonds between the variable and constant domains2024

    • 著者名/発表者名
      Yoshikawa Moeka、Senda Miki、Nakamura Hitomi、Oda-Ueda Naoko、Ueda Tadashi、Senda Toshiya、Ohkuri Takatoshi
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      巻: 700 ページ: 149592~149592

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2024.149592

    • 査読あり
  • [学会発表] 抗体医薬アダリムマブFabの可変-定常ドメイン間へのSS結合導入による熱安定性の上昇2023

    • 著者名/発表者名
      吉川萌香、中村仁美、上田直子、植田正、大栗誉敏
    • 学会等名
      第23回日本蛋白質科学会年会

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公開日: 2024-12-25  

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