アレルギー疾患の病態形成に関与する常在細菌と自然免疫細胞応答の解析

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K07017
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 肥田 重明 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 教授 (10345762)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 炎症 / シグナル伝達 / アレルギー / サイトカイン / 常在細菌

研究実績の概要

炎症反応に影響を及ぼす因子として、細菌や植物由来分子を含む環境因子があるが、アレルギー炎症などの２型免疫反応に関連する分子機構については不明な点が多い。環境との接点である皮膚，粘膜系に存在する常在細菌由来因子や環境中の植物由来因子などのタンパク質や代謝産物は、宿主免疫応答に影響を与え、アレルギー疾患などの慢性炎症の発症や増悪に関与していると考えられる。このような生理活性分子群による免疫反応の分子メカニズムを明らかにすることは、健康維持や疾患発症・悪化を含めたQOLを考える上で重要な課題である。本研究課題では、IL-4, IL-13等のサイトカイン産生や化学伝達分子放出を指標に黄色ブドウ球菌由来因子や植物由来因子について、免疫作用を調べた。黄色ブドウ球菌や乳酸菌などの菌体は主にマクロファージや樹状細胞に対して活性化を誘導し、TNFやIL-6等の炎症系サイトカインの産生を誘導する。さらに黄色ブドウ球菌由来の分泌毒素には、マスト細胞や好塩基球に対して、単独でIL-4等のサイトカインなどを誘導する分子やIgE/抗原やイオノマイシンの刺激を増強する作用を持つ分子が存在することを明らかにした。単独で作用する分子は、Src ファミリーのリン酸化酵素阻害剤やMAPK阻害剤などでサイトカイン産生を抑制することができた。しかしながら、これまでに免疫細胞に発現しているこれらの毒素の受容体の同定はできていない。また、植物由来プロテアーゼアレルゲンについても、レポーター細胞をを作成し、スクリーニングを行ったところ、受容体の候補遺伝子を同定した。今後、遺伝子導入やshRNAによる発現抑制を行い、分子機構についても解析を行う。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は、主にNFATやNFkBなどの転写因子のレポーター細胞を作成し、機能的な解析から常在細菌や植物由来プロテアーゼアレルゲンの受容体の同定を試みて、一部の候補分子を同定できた。常在細菌由来の分泌毒素には様々なドメインが存在し、種々の変異体を作成することで、炎症を誘導する活性に重要なアミノ酸配列が明らかになった。その研究過程で免疫細胞の糖鎖を介して結合する分子があることも明らかにできた。これらの糖鎖結合部位は毒素による炎症誘発に重要であると考えているが、サイトカイン発現や脱顆粒を促進するには糖鎖結合部位以外の領域でシグナルを伝えている可能性が高い。植物由来プロテアーゼアレルゲンの受容体については、候補遺伝子がレトロウイルスによる遺伝子導入やshRNAによる発現抑制でサイトカイン産生に影響があることを観察できている。興味深いことにIL-4はプロテアーゼ活性に依存しているが、その他の炎症性サイトカインや遺伝子発現はプロテアーゼ活性には依存していないことも観察できている。複数の受容体の存在が示唆された。
またT細胞などから産生される IL-3 などのサイトカイン存在下で、細菌由来毒素や植物由来のアレルゲンに対する反応性が顕著に増強された。さらにin vivoの実験系においても、T細胞由来サイトカインを投与することで、顕著に好塩基球のIL-4産生能が増加した。骨髄由来培養好塩基球を用いてIL-3 依存的にmRNAが増加する分子を同定できたことから、これらの分子群の解析を行うことで新しいアレルギーなどの治療標的分子を同定できる可能性がある。

今後の研究の推進方策

細菌由来分泌毒素はマスト細胞や好塩基球などに対し、細胞死を誘導しない。この結果から、細胞表面上の受容体の存在が示唆される。これまでに受容体が同定できていない分子については、遺伝子ライブラリーをレポーター細胞に導入し、再度検討する。また細胞表面への結合が確認できた分子については、免疫沈降と質量分析を用いて結合タンパク質の解析を加える。細菌由来分子の生体内での生理的な役割について、皮膚炎、食物アレルギーモデル，喘息モデルやなどを作成して症状への影響を調べる。さらに細菌由来分子に対する中和抗体，阻害ペプチドや低分子化合物を用いて、in vivoでモジュレーション可能か否かについて検討を加えていく。卵白アルブミン特異的なT細胞受容体トランスジェニックマウス(OT-II Tg)を用いて、CD4+ヘルパーT細胞のTh2分化への影響を検証し、疾患発症や悪化に関与するか検討を加える。

次年度使用額が生じた理由

本研究課題の目的の１つである遺伝子の同定に必要な実験系の構築と培養実験が予定より早期に樹立できたため、必要な抗体、培養用試薬類に予定していた予算を次年度に回すことができた。さらに本研究課題の研究の精度を高めるための試薬類、ベクター、抗体の購入することで、より成果を期待できる。次年度以降に予定している動物実験や遺伝子変異マウスなどの維持管理に必要な費用としても利用する。

研究成果

• [雑誌論文] Comparative Study of the Susceptibility to Oxidative Stress between Two Types of Mycobacterium bovis BCG Tokyo 172 (2021)
  • 著者名/発表者名: 2.Keiichi Taniguchi, Daisuke Hayashi, Naomi Yasuda, Mao Nakayama, Kaori Yazawa, Shouta Ogawa , Yuji Miyatake, Saki Suda, Haruka Tomita, Miki Tokuda, Saotomo Itoh, Jun-Ichi Maeyama, Naoya Ohara, Saburo Yamamoto, Shigeaki Hida, Kikuo Onozaki, Takemasa Takii
  • 雑誌名: mSphere 巻: 6 ページ: e00111-00121
  • DOI: 10.1128/mSphere.00111-21.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Short-chain fatty acids bind to apoptosis-associated speck-like protein to activate inflammasome complex to prevent Salmonella infection (2020)
  • 著者名/発表者名: Hitoshi Tsugawa, Yasuaki Kabe, Ayaka Kanai, Yuki Sugiura, Shigeaki Hida, Shun'ichiro Taniguchi, Toshio Takahashi, Hidenori Matsui, Zenta Yasukawa, Hiroyuki Itou, Keiyo Takubo, Hidekazu Suzuki, Kenya Honda, Hiroshi Handa, Makoto Suematsu
  • 雑誌名: PLoS Biol. 巻: 18 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.3000813. eCollection 2020 Sep
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Anti-Inflammatory Activity of Kurarinone Involves Induction of HO-1 via the KEAP1/Nrf2 Pathway (2020)
  • 著者名/発表者名: Sakiko Nishikawa, Yasumichi Inoue, Yuka Hori, Chiharu Miyajima, Daisuke Morishita, Nobumichi Ohoka, Shigeaki Hida, Toshiaki Makino, Hidetoshi Hayashi
  • 雑誌名: Antioxdants 巻: 9 ページ: -
  • DOI: 10.3390/antiox9090842.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Staphylococcal superantigen-like 12 induces the production of interleukin 4 in murine basophils (2020)
  • 著者名/発表者名: Saishi Nishiyama, Ayaka Urabe, Arisa Morikawa, Masato Kobayashi, Kikuo Onozaki, Saotomo Itoh, Shigeaki Hida
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 532 ページ: -
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.08.029. Epub 2020 Aug 25
  • 査読あり
• [学会発表] T細胞依存的な好塩基球のIgE抗体反応性増強作用 (2020)
  • 著者名/発表者名: 北野拓真，岸田啓太郎，瀧伸介，伊藤佐生智，肥田重明
  • 学会等名: 第84回 日本生化学会中部支部例会
• [学会発表] 黄色ブドウ球菌毒素SSL12によるマスト細胞の活性制御 (2020)
  • 著者名/発表者名: 金光東，井上ひかる，占部彩花，緒方郁奈，小林正都，北野拓真，滝藤遥希，林知仁，大矢進，肥田重明，伊藤佐生智
  • 学会等名: フォーラム2020 衛生薬学・環境トキシコロジー
• [学会発表] ビフィズス菌を用いた新規DDSの構築と安全性の検討 (2020)
  • 著者名/発表者名: 伊藤佑真、藤岡直人、伊藤佐生智、谷口俊一朗、肥田重明
  • 学会等名: 第32回日本薬学会生物系薬学部会主催微生物シンポジウム
• [学会発表] T細胞依存的な好塩基球のIgE抗体反応性増強作用と細胞内シグナル伝達 (2020)
  • 著者名/発表者名: 北野拓真，岸田啓太郎，松井優佳，瀧伸介，伊藤佐生智， 肥田重明
  • 学会等名: フォーラム2020 衛生薬学・環境トキシコロジー
• [学会発表] 黄色ブドウ球菌毒素SSL12によるマスト細胞・好塩基球の活性化 (2020)
  • 著者名/発表者名: 伊藤佐生智、西山彩史、占部彩花、森川ありさ、小林正都、北野拓真、肥田重明
  • 学会等名: 日本薬学会 第141年会