アレルギー疾患の病態形成に関与する常在細菌と自然免疫細胞応答の解析

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K07017
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 肥田 重明 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 教授 (10345762)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 炎症 / アレルギー / シグナル伝達 / サイトカイン / 常在細菌

研究実績の概要

様々な環境因子によって、宿主免疫反応が影響することは知られているが、アレルギー炎症などの２型免疫反応に関連する分子機構については不明な点が多い。特に皮膚，粘膜系に存在する常在細菌や寄生虫由来分子や植物由来因子などのタンパク質は、宿主免疫応答に影響を与え、アレルギー疾患などの慢性炎症性疾患の発症や増悪に関与していると考えられる。このような生理活性分子群による免疫反応の分子メカニズムを明らかにすることは、健康維持と疾患発症や悪化を含めたQOLを考える上で重要な課題である。本研究課題では、IL-4, IL-6, IL-13等のサイトカイン産生や化学伝達分子放出を指標に常在細菌由来分子や植物由来分子について、免疫応答への影響を調べる。ブドウ球菌、乳酸菌などの常在菌の菌体は主にマクロファージなどの自然免疫細胞を活性化し、TNF-αやIL-6等の炎症系サイトカインの産生を誘導する。さらに黄色ブドウ球菌由来の分泌タンパク質には、マスト細胞や好塩基球に対して、IL-4などのTh2サイトカインを誘導する分子やIgE/抗原やイオノマイシンの刺激を増強する作用を持つ分子が存在することを明らかにしている。単独で作用する炎症誘発分子は、Src ファミリーのリン酸化酵素阻害剤やMAPK阻害剤などでサイトカイン産生を抑制することができた。しかしながら、これまでに免疫細胞に発現しているこれらの菌体分子の受容体の同定はできていない。また、植物由来プロテアーゼアレルゲンについても、レポーター細胞を作成し、スクリーニングを行い、受容体遺伝子について検討している。今後、遺伝子導入やshRNAによる発現抑制を行い、環境因子と免疫細胞の相互作用からアレルギー疾患の病態解析を考えていく。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

アレルギー炎症に重要なサイトカインとして、Th2細胞, 好塩基球, マスト細胞から産生されるIL-4, IL-13 が重要視されている。NFATなどの転写因子のレポーター細胞を作成し、機能的な解析から常在細菌や植物由来分子とその受容体の同定を試みて、一部の候補分子を同定できた。常在細菌由来のタンパク質には様々なドメインが存在し、種々の変異体を作成することで、炎症誘導活性に重要なアミノ酸配列を明らかにできた。その中には糖鎖を介して結合する分子があり、サイトカイン発現や脱顆粒を促進するには糖鎖結合部位とそれ以外の2つの領域で免疫シグナルを伝えていることが示唆される結果を得ている。植物由来プロテアーゼアレルゲンは、抗体受容体のアダプター分子であるFcRγに結合する受容体であることから、遺伝子導入やshRNAによる発現抑制でNFAT-レポーター細胞を用いて機能的な解析を行っている。その過程で、NFAT活性とIL-4産生はシステインプロテアーゼ活性に依存しているが、IL-6などの炎症性サイトカインやその他の遺伝子発現はプロテアーゼ活性には依存していないことがmRNAの発現から観察できている。これらの結果はシステインプロテーゼによるサイトカイン産生には複数の受容体からのシグナル伝達経路が関与すると考えられる。また活性化T細胞などから産生される IL-3 存在下で、好塩基球は細菌由来分子や植物由来のアレルゲンに対する反応性が顕著に増強された。さらにin vivoの実験系においても、T細胞を活性化することで、IgE依存的なIL-4産生が促進された。骨髄由来培養好塩基球を用いてIL-3 依存的にmRNAが増加する分子を同定できたことから、これらの分子群の解析を行い、アレルギー疾患の新しい治療標的分子の検討を行っている。

今後の研究の推進方策

細菌由来物質には自然免疫細胞などに対し、細胞死を誘導する分子と細胞死を誘導しない分子がある。マスト細胞などはIgE刺激によって、IL-1βmRNAが誘導されるが、培養上清中には、IL-1βタンパクを検出できない。細胞死を誘導する分子がインフラマソームを活性化し、細胞死とIL-1βの産生を誘発する可能性についても明らかにする。細胞死を誘導しない分子については、細胞表面上の受容体の存在が示唆される。これまでに受容体が同定できていない分子については、遺伝子ライブラリーをレポーター細胞に導入し検討する。また細胞表面への結合が確認できた分子について、免疫沈降と質量分析を用いて結合タンパク質の解析を行ったところ、糖鎖を介して結合する受容体分子を同定した。本年度、細胞表面分子を介したシグナル伝達について解析を行う。さらに細菌由来分子の生体内での生理的な役割について、皮膚炎、食物アレルギーモデル，喘息モデルやなどを作成して症状への影響を調べる。種々の遺伝子欠損マウスや卵白アルブミン特異的なT細胞受容体トランスジェニックマウス(OT-II Tg)を用いて、Th2分化や抗体産生への影響を検証し、アレルギー応答についても解析を行う。

次年度使用額が生じた理由

本研究課題の目的である遺伝子の同定に必要な実験系の構築と培養実験系の確立が予定より早期に樹立できたため、必要な抗体、培養用試薬類に予定していた予算を次年度に回すことができた。本研究課題の精度を高めるための免疫実験試薬類、ベクター、試薬を購入することで、より成果を期待できる。次年度以降に予定している動物実験や遺伝子変異マウスを用いた研究に必要な費用として効率よく利用する。

研究成果

• [雑誌論文] 2-Deoxy-d-glucose induces deglycosylation of proinflammatory cytokine receptors and strongly reduces immunological responses in mouse models of inflammation (2022)
  • 著者名/発表者名: Uehara I., Kajita M., Tanimura A., Hida S., Onda M., Naito Z., Taki S., Tanaka N.
  • 雑誌名: Pharmacology Research and Perspectives 巻: 10 ページ: e00940
  • DOI: 10.1002/prp2.940
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comparative Study of the Susceptibility to Oxidative Stress between Two Types of Mycobacterium bovis BCG Tokyo 172 (2021)
  • 著者名/発表者名: 2.Keiichi Taniguchi, Daisuke Hayashi, Naomi Yasuda, Mao Nakayama, Kaori Yazawa, Shouta Ogawa , Yuji Miyatake, Saki Suda, Haruka Tomita, Miki Tokuda, Saotomo Itoh, Jun-Ichi Maeyama, Naoya Ohara, Saburo Yamamoto, Shigeaki Hida, Kikuo Onozaki, Takemasa Takii
  • 雑誌名: mSphere 巻: 6 ページ: e00111-00121
  • DOI: 10.1128/mSphere.00111-21.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 炎症初期における好塩基球活性化の IL-3 依存的スイッチング (2021)
  • 著者名/発表者名: 北野拓真、竹森樹里、松井優佳、瀧伸介、伊藤佐生智、肥田重明
  • 学会等名: 日本生化学会中部支部第85回例会
• [学会発表] 黄色ブドウ球菌α毒素によるマスト細胞の活性化増強作用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 緒方郁奈、林知仁、森川ありさ、肥田重明、伊藤佐生智
  • 学会等名: 第67回日本薬学会東海支部総会・大会
• [学会発表] Staphylococcal superantigen like（SSL）12 によるマスト細胞・好塩基球の活性化作用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 占部彩花、森川ありさ、西山彩史、小林正都、北野拓真、肥田重明、伊藤佐生智
  • 学会等名: 第33回 微生物シンポジウム
• [学会発表] HMG-CoA 還元酵素阻害薬による免疫応答制御 (2021)
  • 著者名/発表者名: 石川怜，村瀬香乃，北野拓真，伊藤佐生智，肥田重明
  • 学会等名: フォーラム2021衛生薬学・環境トキシコロジー
• [学会発表] Type2炎症反応に関与する好塩基球のIL-4産生におけるFcRγ の役割 (2021)
  • 著者名/発表者名: 松井優佳，森川ありさ, 伊藤佐生智, 瀧伸介, 肥田重明
  • 学会等名: 日本病院薬剤師会東海ブロック・日本薬学会東海支部合同学術大会
• [学会発表] Immune modulation by Bifidobacteria-derived molecules (2021)
  • 著者名/発表者名: 伊藤佑真、藤岡直人、伊藤佐生智、谷口俊一郎、肥田重明
  • 学会等名: 第50回 日本免疫学会学術集会