研究課題
ビタミンAは、食物から摂取され小腸で吸収された後、代謝を受けて活性型のレチノイン酸 (RA) となる。多岐にわたる作用を有するRAは、生命の根幹となる個体発生、細胞分化にも深く関わる。また、RAがヒト前骨髄性白血病細胞 (HL60細胞) を顆粒球様細胞に分化誘導させ増殖を停止させることから、急性前骨髄球性白血病の治療薬として使われている。RAの作用はRA核内受容体を介した転写発現調節機構で説明されるが、別の作用機構としてレチノイル化 (RAによるタンパク質修飾) が見出され、レチノイル化タンパク質として、α-アクチニン、プロテインキナーゼA (PKA) の調節サブユニット等が同定された。今年度はレチノイル化α-アクチニンの生理的意義を解明するため、HL60細胞のRAによる分化誘導中のα-アクチニンの変化について検討を行った。RA処理したHL60細胞の粗抽出液を用いα-アクチニン-1 或いはα-アクチニン-4に対する抗体で免疫沈降を行い、抗RA抗体で免疫染色を行ったところ、α-アクチニン-4のみが検出されα-アクチニン-4はレチノイル化されていた。次に、RA処理による影響を調べたところ、α-アクチニン-4タンパク質レベルは有意に増加したが、mRNAの発現は変化しなかった。また、RA処理は核から細胞質へα-アクチニン-4の細胞内局在を変化させた。 RAで前処理した細胞は、対照細胞と比較して、シクロヘキシミド処理後もα-アクチニン-4タンパク質レベルを維持した。さらに、RA処理細胞におけるユビキチン化α-アクチニン-4タンパク質の量は、対照細胞よりも少なかった。これらの結果は、RAがα-アクチニン-4タンパク質の核輸送およびプロテアソーム分解を阻害する可能性があることを示した。 α-アクチニン-4は、細胞形態変化の促進を含む、RA誘発性分化において重要な役割を果たす可能性がある。
2: おおむね順調に進展している
研究に不可欠なRA抗体の調製 (大量培養、抗体精製等）に1か月余り費やし、労力を要した。調製できた抗体は少量であったが、RA特異的抗体を調製することができた。また、二次元電気泳動を用いたPKA基質タンパク質の同定は、現在のところほぼ計画通りに進んでいる。また、同定したタンパク質のRA誘導分化における役割も解明しつつある。タンパク質を扱う研究は、ある程度のタンパク質量が必要で、タンパク質の調製に時間と忍耐力を必要とするが、計画通りに研究を進め、着実に結果を早めに出していきたい。
今年度はレチノイル化タンパク質とPKA によりリン酸化されるタンパク質の新たな同定を行ってきたが、今年度は細胞分化におけるレチノイル化、リン酸化の役割を知るための研究に大きくシフトしていく。即ち、1) これらの修飾部位 (アミノ酸) を特定する、2) 修飾部位変異体を作成し、細胞に導入する、3) 細胞分化・増殖との関連を検討する。具体的には、HL60細胞を用いて、レチノイル化PKAによりリン酸化された核内タンパク質のペプチドマップを行い、リン酸化部位を特定する。また、推定リン酸化部位の変異体遺伝子を作成し、RA により増殖が抑制されるヒト乳がん細胞MCF-7を用いて遺伝子導入を行い、PKAによるリン酸化を検討するとともに、PKAタンパク質自身をノックダウンして、RAによる細胞増殖抑制作用を調べる。このように、同定した核タンパク質のリン酸化による遺伝子発現調節への影響を詳細に調べ、タンパク質のレチノイル化の生理的意義を解明していく。次に、PKAによりリン酸化される候補の核タンパク質がPKAによりリン酸化されているかを、免疫染色法、二次元電気泳動、Ms解析を用いて調べる。さらに、遺伝子の発現調節に関わるヒストンのレチノイル化を、免疫沈降法、免疫染色 或いは MS/MS解析を駆使してRA結合部位を調べ、アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化などの修飾反応に及ぼすRAの影響を検討して、RA受容体を介さないRAのノンジェノミックな作用機構をタンパク質修飾という観点から解明する。最終的には、見出した修飾タンパク質自身、或いは、タンパク質修飾を制御する因子であるレチノイル化関連タンパク質に対し、医薬品としての可能性を検討する。
今年度は、コロナ感染拡大によって、2回緊急事態宣言が発令された。そのため当初2020年度に計画していた研究が行えない期間が生じた。本研究では核内レチノイル化PKAによりリン酸化される核内タンパク質の同定とレチノイル化タンパク質の同定を行うため、核タンパク質を二次元電気泳動で分離し、SYPROで染色後、ブロッティング、免疫染色を行い、検出できたタンパク質に対しMS 解析を行っている。よって、継続的な操作を必要とし、その期間を得ることが非常に難しい状況であった。また、RA抗体精製に時間を要したため、これらタンパク質の同定とヒストン修飾解析が年度を跨ぐことになったことから、経費を繰り越すこととなった。
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Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res.
巻: 1868 ページ: 118968
10.1016/j.bbamcr.2021.118968
BPB Reports
巻: 4 ページ: 41-46
10.1248/bpbreports.4.1_41
Biol. Pharm. Bull.
巻: 43 ページ: 1081-1087
10.1248/bpb.b20-00083
Gene Reports
巻: 19 ページ: 100665
10.1016/j.genrep.2020.100665
