| 研究課題/領域番号 |
20K07037
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
定家 真人 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 准教授 (70415173)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | がん / 天然化合物 / クロマチン / バイオマーカー / 骨肉腫 |
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| 研究実績の概要 |
カビ由来の天然化合物AusDは、正常細胞への毒性は低く一部のがん細胞に選択的な毒性を示すため、個別化医療に利用できる新規抗がん薬の種となる可能性がある。一方でAusDによる細胞増殖抑制の分子機序の詳細や、AusDに高感受性を示すがんに共通するバイオマーカーは明らかにされていない。応募者らはこれまでの研究で骨肉腫由来の細胞株の一つのグループに対し高い毒性を示す化合物としてAusDを単離した。本研究ではがん細胞のAusD高感受性を決定づける遺伝的背景や遺伝子発現の特徴を見出し、AusDによる細胞増殖抑制の分子機序を明らかにすることを目的とする。本研究計画ではがん細胞のAusD高感受性と相関する遺伝的背景や遺伝子発現変化（バイオマーカー）の網羅的な探索を行い、AusD高感受性の決定に関わる遺伝子を同定する。また、AusDの細胞増殖抑制の分子機序を調べたうえで、バイオマーカーとなる特徴がAusD高感受性にどう関わるかを調べる。本研究の成果により新しい治療対象を有する抗がん薬としてAusDを提案できる可能性があり、学術的のみならず医学的・薬学的にも意義深いものになることが期待される。
本年度は、研究実施計画にしたがい、CYP2J2発現量レベルが高い株がAusD高感受性を示すことの一般性を確認するため、主に骨肉腫由来細胞株を含む合計13株について、AusD処理後の生存率と、CYP2J2のmRNAの量を調べ、それぞれ数値化して表示させたところ、AusD感受性の高さは、CYP2J2の発現レベルの高さと強く正相関することがわかった。CYP2J2が直接AusDをエポキシ化するかどうかを調べるために、大腸菌を用いてCYP2J2の組換え蛋白質の調製を試みた。AusDの細胞傷害性にCYP2J2の酵素活性が必要であるかどうかを調べるため、CYP2J2の酵素活性に必要なアミノ酸変異体の遺伝子を作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度はまず、CYP2J2発現量レベルが高い株がAusD高感受性を示すことの一般性を確認するため、新たに入手した骨肉腫由来細胞株6株を含む合計13株について、AusD処理後の生存率を調べたところ、骨肉腫由来3株が、他の細胞に比べてAusD高感受性を示すことがわかった。
次に、初めに調べた13細胞株（骨肉腫由来細胞株12株とヒト肺由来正常線維芽細胞）でのCYP2J2発現レベルを調べるため、RT-qPCRによりmRNA量を調べたところ、AusDに対し高感受性を示した6株では、細胞あたりのCYP2J2のmRNAの量が多いことがわかった。
以上の実験結果をまとめ、AusD感受性とCYP2J2の発現レベルをそれぞれ数値化して表示させたところ、AusD感受性と、CYP2J2の発現レベルの間の相関係数rは0.996であったため、AusD感受性の高さは、CYP2J2の発現レベルの高さと強く正相関することがわかった。
AusDは、細胞内でシトクロムP450（CYP）によりエポキシ化され、DNAのグアニンと共有結合を形成することでDNA損傷を誘導すると考えられているが、AusDを細胞に作用させることでDNA 2本鎖切断が導入されること以外は予想の域を出ていない。そこで、CYP2J2が直接AusDをエポキシ化するかどうかを調べるために、大腸菌を用いてCYP2J2の組換え蛋白質の調製を試みた。また、AusDの細胞傷害性にCYP2J2の酵素活性が必要であるかどうかを調べるため、CYP2J2の酵素活性に必要なアミノ酸変異体の遺伝子を作製した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の研究で、CYP2J2発現量レベルが高い株がAusD高感受性を示すことの一般性を明らかにしたが、今後は、CYP2J2の組換え蛋白質とAusDを電子供与体存在下で混合し、AusDエポキシドが生成されるかどうかを質量分析法により調べる。
これと並行して、CYP2J2の酵素活性に必要なアミノ酸変異体と野生体をそれぞれAusD感受性の低い細胞で発現させ、AusD感受性が変化するかどうかを調べることで、AusD高感受性にCYP2J2の酵素活性が必要かどうかを調べる。
その後、これまでに得られた実験結果と総合して、AusDの細胞傷害性にCYP2J2のエポキシ化活性が必要であることを明らかにする。このことにより、AusDに高い感受性を示すがん細胞の特徴としてCYP2J2の発現量の亢進が認められることを示す。
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