| 研究課題/領域番号 |
20K07067
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
神戸 悠輝 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 講師 (60549913)
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| 研究分担者 |
宮田 篤郎 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (60183969)
栗原 崇 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (60282745)
山下 哲 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (40740197)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド / ガラニン / 摂食制御 / アデノ随伴ウイルス / RNA干渉 / ファイバーフォトメトリー / 行動実験 |
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| 研究実績の概要 |
今年度は、昨年度に引き続き視床下部に発現する神経ペプチドであるガラニンによる摂食調節メカニズムを解析した。研究代表者のこれまでの研究において、視床下部腹内側核に発現する下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド (PACAP) が摂食調節に重要な役割を担うことを報告している (Trung and Kambe, Mol. Neurobiol. 2020)。そこで、視床下部腹内側核PACAP発現神経細胞がどのような神経核に投射するかを解析する目的で、PACAPのプロモータでCreリコンビナーゼを発現するマウス (PACAP-Creマウス) の腹内側核に、Cre依存的にシナプトフィジンEGFP (発現細胞の軸索末端を緑色に標識) を発現するアデノ随伴ウイルス (AAV) を感染させた。その結果、視床下部背内側核は強く、視床下部弓状核は弱く緑色蛍光が観察されたものの、視床下部室傍核においてはほとんど緑色蛍光が観察されなかった。すなわち、視床下部腹内側核PACAP発現神経細胞は背内側核に投射するものの、室傍核にはほとんど投射しない可能性が推察された。そこで、背内側核のガラニンをノックダウンするために、ガラニンに対するshRNAを発現するAAVを感染させた。背内側核のガラニンをノックダウンすると、オープンフィールド試験における自発活動量および内部区画滞在時間 (不安様行動の指標) には著明な変化は見られなかったものの、日中の摂食量の増加、夜間および絶食後の摂食量の減少が観察され、非常に興味深いことにこのフェノタイプはPACAPノックアウトマウスと同じだった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
視床下部背内側核ガラニン発現神経細胞の機能解析において大きな進展が見られた。ガラニンは視床下部に比較的選択的に高発現する神経ペプチドであり、視床下部内において、室傍核、視交叉上核、背内側核、弓状核に高発現することを、既存のデータベース検索によって明らかにした。研究代表者は、新しい技術として細胞種特異的な神経回路標識手法を用いて、視床下部腹内側核下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド (PACAP) 発現神経細胞特異的に順行性神経回路標識を実施した。その結果、腹内側核PACAP発現神経細胞は背内側核に神経投射するが、室傍核には神経投射しない可能性が明らかになった。腹内側核PACAP発現神経細胞の背内側核への強い神経投射はこれまで報告が無い。この結果を受けて、腹内側核のPACAPは背内側核のガラニンを介して摂食を制御すると仮定した。そこで、背内側核のガラニンをshRNA発現AAVを用いてノックダウンすると、PACAPノックアウトマウスと同様のフェノタイプを示し、予想通りの結果となった。背内側核ガラニンの摂食に対する作用を報告した既報もほとんど存在しない。本研究成果をまとめて現在論文投稿準備中である。上記のように進捗した為、達成度の区分を順調に進展しているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
ガラニンのノックダウンは、本年度背内側核で実施したが、比較対象として視床下部腹内側核下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド (PACAP) 発現神経細胞が神経投射していないと考えれる室傍核においても実施し、摂食制御に対する影響を測定する。一方、引き続き視床下部弓状核に存在する、アグーチ関連ペプチド (AgRP) およびプロオピオメラノコルチン (POMC) 発現細胞の機能解析を実施する。すなわち、AgRPのプロモータに関しては、前回は約1000 bpのプロモータを用いたが、アデノ随伴ウイルス (AAV) へのパッケージのキャパシティとして、あと約1500 bpを追加することができるので、AgRP発現細胞に特異的な発現を可能にするために使用するプロモータ領域を拡張するとともに、より強い発現を達成するために、最小サイトメガロウイルスプロモータを組み込んだ発現プラスミドおよびAAVを作成する。また、少なくともプロオピオメラノコルチンプロモータはワークすることを確認しているので、同プロモータの下流でカルシウム感受性蛍光タンパク質を発現させるとともに、視床下部腹内側核PACAP発現細胞特異的にデザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体を発現させ、昼間および夜間にクロザピン-N-オキシドを投与し、視床下部腹内側核PACAP発現細胞を活性化させたときのプロオピオメラノコルチン発現細胞の神経活動を記録する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度50万円を前倒し支払い請求し、ファイバーフォトメトリーをGCaMPのみならず、同時にRCaMPを測定するための部品の購入を予定していたが、コロナウイルスによる輸入障害により当該物品の購入ができず、次年度使用額が生じた。来年度は、当該部品の購入と、当初予定していた実験への支出を計画している。
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