| 研究課題/領域番号 |
20K07093
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| 研究機関 | 京都産業大学 |
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研究代表者 |
棚橋 靖行 京都産業大学, 生命科学部, 准教授 (60582418)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Piezo1チャネル / 機械刺激受容チャネル / 大腸運動 / 平滑筋細胞 / Ca2+ |
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| 研究実績の概要 |
消化管平滑筋には，伸展などの機械刺激により開口する陽イオンチャネルの存在が古くから知られている。しかし，このチャネルの分子実体は特定されておらず，消化管運動調節におけるその役割については不明な点が多く残されている。昨年度の研究により，大腸運動調節における機械刺激受容性陽イオンチャネルPiezo1の関与が示唆された。今年度は，以下の点について検討を行った。
１．Piezo1チャネルの発現と局在：赤色蛍光蛋白質であるtdTomatoとPiezo1の融合蛋白質を発現するマウスの大腸から平滑筋細胞標本および神経細胞標本を作製し，tdTomatoに対する抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。その結果，Piezo1蛋白質は，平滑筋細胞のみならず一部の内在性神経細胞においても発現することが示唆された。
２．平滑筋細胞におけるPiezo1電流測定：正常マウスから作製した大腸平滑筋細胞標本において，Piezo1作動薬であるYoda1を適用したところ，内向き電流が発生した。今後，平滑筋特異的Piezo1ノックアウトマウスの細胞を用いて，発生した電流がPiezo1チャネルを介したものか確認する。
３．Piezo1チャネルより下流の収縮調節メカニズム：Piezo1作動薬であるYoda1により誘発された収縮反応に対する各種Ca2+チャネルおよびCa2+トランスポーターに対する阻害薬の効果を検討した。その結果，結腸輪走筋においては，Na+/Ca2+ exchangerのリバースモードを介して流入するCa2+が，一方，縦走筋においては，ストア作動性Ca2+チャネルOraiを介して流入するCa2+が，Piezo1チャネルの下流シグナルとして重要な役割を果たしていることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
研究実績の概要で述べた通り，Piezo1チャネルを介した平滑筋収縮調節機構におけるCa2+動員経路についてはおおむね計画通り研究を進めることができた。しかしながら，Piezo1平滑筋特異的ノックアウトマウスの作製に必要なPiezo1 flox系統マウスの自家繁殖がうまくいかず，一時，途絶えてしまった。途絶えた系統のマウスを再度，導入したものの，Piezo1平滑筋特異的ノックアウトマウスの供給が大幅に遅れ，同マウスを用いた実験に相当の遅れが生じた。以上のことから「遅れている」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度までに得られた結果から，平滑筋細胞に発現するPiezo1チャネルが大腸運動の制御に関与している可能性が考えられた。最終年度，この仮説を裏付けるために，Piezo1平滑筋ノックアウト（KO）マウスを用いた研究を進める。まず，同KO マウスにおいて大腸輸送能を測定し，正常マウスの場合と比較する。また，同KOマウスから作製した大腸片標本において，Piezo1作動薬であるYoda1を投与した時の蠕動運動および平滑筋収縮活性の変化を記録し，正常マウスの場合と比較する。さらに，正常マウスとKOマウスから大腸平滑筋細胞標本を作製し，標本に機械刺激またはYoda1を適用したときに生じる電気的活性変化について解析する。
上記に加えて，コリン作動性神経によるPiezo1チャネル調節機構についても検討する予定である。具体的には，Piezo1 KOマウスの大腸片標本において経壁電気刺激によりコリン作動性神経を刺激したときの収縮反応を記録し，正常マウスの標本の反応と比較・解析する。この点については，正常マウスを用いて予備実験をすでに行っている。次に，大腸平滑筋細胞標本において，Yoda1および機械刺激により誘発したPiezo1電流に対するムスカリン受容体刺激の効果をパッチクランプ法により検討する。
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