| 研究課題/領域番号 |
20K07238
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| 研究機関 | 秋田大学 |
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研究代表者 |
八月朔日 泰和 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (00372334)
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| 研究分担者 |
吉川 究 秋田大学, 医学系研究科, 助教 (90400481)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ホスホリパーゼD / ジアシルグリセロールキナーゼ / 特異抗体 / 滑面小胞体 / 免疫組織化学染色 / 海馬 / プルキンエ細胞 / 介在ニューロン |
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| 研究実績の概要 |
令和２年度はDGKアイソザイム(DGKg・DGKi)およびPLDアイソザイム(PLD1・PLD2)の中枢神経系における組織発現と細胞内局在解析および培養細胞における発現局在解析を行った。
１） DGKアイソザイム(DGKg・DGKi)の中枢神経系における組織発現と細胞内局在解析：① DGKg-共焦点レーザー顕微鏡を用いた多重染色法による解析により、DGKg免疫反応がラット海馬投射ニューロン、大脳皮質投射ニューロンおよび小脳プルキンエ細胞の細胞体と樹状突起に顆粒状に検出された。また各領域における介在ニューロンにも発現を認めた。免疫電子顕微鏡法により、DGKgは小脳プルキンエ細胞樹状突起において滑面小胞体に局在することを見出した。② DGKi-DAB染色により、同様に核移行シグナルを有するDGKzと異なり、DGKiはラット脳神経細胞において細胞質に局在することが明らかとなった。
２） PLDアイソザイム(PLD1・PLD2)の中枢神経系における組織発現と細胞内局在解析および培養細胞における発現局在解析：① PLD1-ウェスタンブロット法にて、マウス脳における発現を認めた。脳の他に肺、心臓、肝臓、腎臓における発現が検出された。NIH3T3細胞を用いた形態学的解析により、PLD1免疫反応は細胞質に粗な顆粒状に認められ、弱く核にも検出された。マウス脳の神経細胞においてはPLD1免疫反応は細胞質に認められた。② PLD2-ウェスタンブロット法にて、マウス脳における発現を認めた。脳以外の臓器では反応は検出限界以下であり、発現していないか発現していても少量と考えられた。マウス脳の神経細胞においてはPLD2免疫反応は細胞質に認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和２年度の研究計画では、以下の目標を挙げた。
DGKアイソザイム(DGKg・DGKi)およびPLDアイソザイム(PLD1・PLD2)の中枢神経系における組織発現と細胞内局在解析【令和２年度～３年度】
本年度に関して申請者はDGKgがラット脳の投射ニューロンおよび介在ニューロンに発現し、免疫電子顕微鏡法により小脳プルキンエ細胞の樹状突起においてDGKgが滑面小胞体に局在することを明らかにした。またPLD1およびPLD2のマウス脳における発現局在を明らかにした。以上より、当該課題の「研究の目的」に対する達成度は、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和３年度は以下の点につき解析を行う。
１）DGKアイソザイム(DGKg・DGKi)およびPLDアイソザイム(PLD1・PLD2)の中枢神経系における組織発現と細胞内局在解析【令和２年度からの継続】
● 蛍光多重染色法による解析（共焦点レーザー顕微鏡）：DGKiはラット脳について、PLDアイソザイムはマウス脳の各領域について、蛍光多重染色によりさらに発現局在解析を進める。
● 免疫電子顕微鏡法による解析：包埋前（DAB・銀増感）および包埋後免疫電子顕微鏡法により、DGKiおよびPLD1・PLD2の神経細胞内微細局在の解析を行う。
２）PLD1・PLD2の脳内発現および局在変化を生じる分子や刺激の探索：カイニン酸注入や虚血刺激によるPLD2のマウス脳内発現量や神経細胞内局在の変化を特異抗体で確認する。さらに、PLD1とPLD2の発現や局在変化を生じる新規分子や刺激の探索を行う。
３）PLD1・PLD2の末梢臓器における組織発現と細胞内局在解析：ウェスタンブロット法によりマウス各臓器におけるPLD1・PLD2のタンパクレベルでの発現を解析する。それを元にPLD1とPLD2抗体で免疫組織化学染色を行い、各種顕微鏡により各臓器における発現細胞や細胞内局在を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和２年度の物品購入において直接経費所要額の約0.3%相当の残金が生じた。
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