| 研究課題/領域番号 |
20K07246
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
小路 武彦 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (30170179)
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| 研究分担者 |
柴田 恭明 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 准教授 (80253673)
末松 貴史 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 技術職員 (70264249)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 精母細胞 / 核小体 / DNAメチル化 / pre-rRNA及びrRNAs / 電顕ISH / ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子局在 / マウス |
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| 研究実績の概要 |
哺乳類精子形成過程は、規則的な増殖・分化を経て徐々にクロマチンを凝集させ完全にヘテロクロマチン化した精子核を形成する過程であり、エピゲノム因子による調節が示唆されている。特に、減数分裂前期に残存する核小体周囲のヘテロクロマチンが染色体配置に重要な役割を果たす可能性がある。本研究ではマウス精巣に於いて、減数分裂前期で残存する核小体の形態や機能をrDNA局在やrRNAsの産生・分布及びリボソームサブユニット形成動態から検討し、減数分裂時に発現切り替えが生じるPgk-1及びPgk-2遺伝子の発現及び局在変化との関係やエピゲノム因子のこれら核小体機能や染色体分布制御への関与を解明することを目的とした。
本年度は、正常精母細胞核小体で光顕レベルでのin situ hybridization (ISH)による28S rRNAの過剰発現を確認すると共に、核小体付近での5-メチルシトシンの強陽性と5-ハイドロキシメチルシトシンの陰性を見出した。一方HELMET法による解析では、核小体でのCCGG配列は低メチル化状態であり、GATCG配列自体が検出限界以下であった。Pre-rRNA、18S rRNA、28S rRNA及びspacer rRNAに対するオリゴDNAを用いた電顕ISH二重染色法により、pre-rRNAはrDNAが存在するfibrillar center周囲に局在し、dense fibrillar componentやgranular componentで明らかな28S rRNAシグナルの増大とspacer rRNAの核小体内外でのランダムな分布を見出した。一方、X染色体上にあるPgk-1遺伝子と17番染色体上のPgk-2遺伝子の核内位置を同定するin situ PCRの反応条件の再検討を行い、パラフィン切片での特異性の向上とヘテロクロマチンとの関係解明に努めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
先ず、これまでの研究提案の根拠となる現象の再現性の確認を行うと共に、同時に計画していた実験を大方実行できた点、スタートラインとしては順調であると考えている。また、水溶性樹脂包埋の精巣薄切切片を用いてプローブの浸透性の増大を図るとともに、形態に有害なホルムアミドを用いずヌクレオチド混液による必要なストリンジェンシーを実現する試みにより極めて有効に金コロイド粒子の検出に成功しており、5 nmと10 nmの異なるサイズの金コロイド粒子用いて二重染色法への応用も可能とした点大いに評価できる進展であったと思われる。In situ PCRによるPgk-1並びにPgk-2遺伝子の局在化には、これまでの条件では凍結切片では有効であったが、解像力を上げるためのパラフィン切片では非特異反応が高く、更なる反応条件の検討を必要としている。それぞれの転写産物であるmRNAは検出出来ているので、近い将来ヘテロクロマチン領域とそれら遺伝子の発現制御との関連を明らかにすることが出来るものと考えている。5-azadC投与マウス試料は既に作成済みなので今後はエピゲノムの関与の検討へと進めていきたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
電顕ISHによるpre-rRNA並びにその種々の領域の核小体内分布結果を定量的に解析し、セルトリ細胞核小体での結果などと比較することにより、減数分裂時での精母細胞核小体の機能的な変化に対する洞察を得る。
また、5-azadC投与マウス精巣切片にて、核小体並びにその周辺のクロマチンのメチル化状態を免疫組織化学的に検出し、その結果とISHによる18S並びに28S rRNAの分布状態と超解像顕微鏡を用いて比較検討することにより、DNAの脱メチル化による核小体構造の変化や周囲のヘテロクロマチンとの関係を明らかにする。更に、5-azadC投与精巣にてin situ PCRによりPgk-1及びPgk-2遺伝子位置の変化を解析し、mRNA発現結果と照合しヘテロクロマチン領域との関連を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）新型コロナの関係で第１６回国際組織細胞学会の講演が延期になり、また日本顕微鏡学会、日本組織細胞学会、日本解剖学会など国内の学会がすべてオンライン開催となり、旅費の支出が無かったため。
（使用計画）次年度の旅費もしくは消耗品に使用。
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