| 研究課題/領域番号 |
20K07249
|
|---|
| 研究機関 | 神奈川大学 |
|---|
研究代表者 |
藤原 研 神奈川大学, 理学部, 准教授 (00382945)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | 低酸素 / 下垂体前葉 / 細胞間相互作用 / 局所環境 / 内分泌 / ホルモン |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は①低酸素応答細胞の組織学的解析、②低酸素シグナルを介する細胞間相互作用、③低酸素シグナルによる細胞機能調節、について解析する。本年度は、「①低酸素応答細胞の組織学的解析」について行った。まず、ラットを用いて正常組織での低酸素応答細胞を免疫組織化学的手法により検出する実験系の確立を行った。Pimonidazoleは生きた細胞の中に取り込まれて、低酸素状態では還元されてタンパク質のチオール基に結合する性質を持つ。そのため、抗pimonidazole抗体を用いることで低酸素状態にある細胞を免疫組織化学で検出することができる。そこで、成体雄ラットに投与するpimonidazole溶液を濃度と投与後のインキュベート時間を検討した。また、組織の固定法及び免疫組織化学の各種条件検討を行った。その結果、常に低酸素に曝されている消化管上皮細胞を指標として、免疫組織化学でpimonidazole陽性細胞を検出する形を確立できた。この条件で下垂体を解析したところ、pimonidazole陽性と思われる反応が得られた。この陽性反応の検証を行うため、雄の成体個体より血流やホルモン細胞の活動が変化するような条件でも検討し始めた。続いて、低酸素応答細胞の細胞同定をするために各細胞種のマーカー分子や分泌性因子、受容体などの機能分子のmRNAをin situ hybridization（ISH）法により検出する系を確立した。下垂体前葉から作製したcDNAを用いてPCR法により目的の分子をクローニングし、in vitro transcription法でdigoxigenin標識した一本鎖RNAプローブを合成し、ISH法により標的細胞を検出することができた。今後は、pimonidazoleの免疫組織化学と各種分子のISHを組合わせて低酸素応答細胞のキャラクタライズを行う予定である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
2020年4月に自治医科大学医学部から神奈川大学理学部に異動し、新たに研究室を主宰した。そのため、新しい研究室でこれまで実施してきた実験系を構築することに時間を要した。さらに、4月より半年間はCOVID-19感染拡大により本学の研究活動が大きく制限されてしまい、実験が長期間にわたり休止せざるを得ない状況にあった。このような状況で、計画していた研究を十分に進めることができなかった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
現在までの研究進捗状況は遅れてはいるが、計画研究の大きな変更はない。2020年度に予定していた低酸素応答細胞の組織学的解析が遅れているため、2021年度は引き続き本実験を行う。一方、2020年度にin vitroで低酸素環境を作ることが可能な培養器を設置することができたため、本装置を用いて培養細胞を使って低酸素環境下での細胞機能の変化を解析する予定である。様々な酸素濃度で変動する遺伝子をDNAマイクロアレイやPCR法により同定する。今後もCOVID-19感染拡大により研究活動が制限される可能性を想定し、DNAマイクロアレイ解析は受託により行い、実験室で研究ができなくなった場合には、コンピューター上でのデータ解析で研究を進められるよう準備もしていく。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
本学では、2020年4月より10月までの半年間はCOVID-19感染拡大により研究活動が著しく制限された。そのため実験ができない期間が長く続き、予定していた実験試薬や機器の発注ができなかった。また、参加する予定であった学会が中止やオンラインでの実施になったため、出張旅費の支出がなかった。本年度に使用できなかった予算は、引き続き次年度の物品費及び旅費に使用する計画である。
|
