細胞種ごとに異なる発現パターンを示す小胞体内イオン輸送体の生理学的意義の解明

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K07256
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 村田 喜理 東北大学, 医学系研究科, 講師 (60455780)
• 研究分担者: 吉田 卓史 帝京平成大学, 薬学部, 准教授 (30455795)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: 小胞体

研究実績の概要

小胞体内のイオン組成が小胞体機能や疾患の発症に重要な役割を果たすことが明らかとなりつつあるにも関わらず;、小胞体内のイオン組成およびその調節機構に は依然、不明な点が多い。本研究では、小胞体に発現するイオン輸送体の種類が細胞種ごとに異なることの生理学的意義の解明を目指す。 そのためにまず、pHをはじめとした小胞体内のイオン組成について、外分泌細胞、B細胞など細胞種ごとに測定を行う。
今年度は、実験に用いるnuclear envelope（NE）標本の膜の配向についての検討を行った。
細胞質領域にpH感受性のGFP（pHluorin）を融合したKCa1.1（Ca2+感受性K+チャネル）とCalnexin（ERマーカーに用いられる１回膜貫通型タンパク質）をそれぞれHEK293細胞に発現させて、NE標本を作成した。pHluorin融合タンパク質を発現したNE標本に対してwhole NEモードのパッチクランプを行い、
電極内液のpHに対するpHluorinの蛍光強度変化を観察したところ、酸性条件の電極内液を用いた時、pHluorinの蛍光が減弱することを観察した。この蛍光強度変化は、中性条件の電極内液を用いた場合には観察されなかった。これは、KCa1.1、Calnexinの細胞質領域がNE標本のlumen側を向いていることを示している。このことから、NE標本における核外膜（ER膜とつながっている）は、標本作成の操作中に反転している可能性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

新型コロナウィルスの影響により、研究分担者との往来に支障が生じ、研究の進捗に影響がでたため。

今後の研究の推進方策

実験条件の検討とコントロールとしての小胞体内イオン濃度の測定のため、HEK (Human Embryonic Kidney)293細胞を用い、蛍光プローブによる小胞 体内のH+、Cl-、K+の濃度測定を行う。

次年度使用額が生じた理由

新型コロナウイルスの影響で往来が困難であることなどから共同研究に支障が生じ、計画通りの研究が行えなかったため、未使用額が生じた。 次年度使用額は、本年度の実験計画の遂行に関わる物品費として使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Capsaicin and Proton Differently Modulate Activation Kinetics of Mouse Transient Receptor Potential Vanilloid-1 Channel Induced by Depolarization (2022)
  • 著者名/発表者名: K. Takahashi, K. Araki, H. Miyamoto, R. Shirakawa, T. Yoshida, M. Wakamori
  • 雑誌名: Front. Pharmacol 巻: 12 ページ: 1107
  • DOI: 10.3389/fphar.2021.672157
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mode-selective inhibitory effects of eugenol on the mouse TRPV1 channel (2021)
  • 著者名/発表者名: K. Takahashi, T. Yoshida, M. Wakamori
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun 巻: 556 ページ: 156-162
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.03.126
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of ultra-rare disruptive variants in voltage-gated calcium channel-encoding genes in Japanese samples of schizophrenia and autism spectrum disorder (2021)
  • 著者名/発表者名: C. Wang, S. ichiro Horigane, M. Wakamori, S. Ueda, T. Kawabata, H. Fujii, I. Kushima, H. Kimura, K. Ishizuka, Y. Nakamura, Y. Iwayama, M. Ikeda, N. Iwata, T. Okada, B. Aleksic, D. Mori, T. Yoshida, H. Bito, T. Yoshikawa, S. Takemoto-Kimura, N. Ozaki
  • 雑誌名: Transl. Psychiatry 巻: 12 ページ: 84
  • DOI: 10.1038/s41398-022-01851-y
  • 査読あり