| 研究課題/領域番号 |
20K07258
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
藤井 拓人 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (50567980)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | K+ポンプ / P型ATPase / 小胞体 / Ca2+シグナリング |
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| 研究実績の概要 |
小胞体は、Ca2+の貯蔵庫であり、小胞体からのCa2+放出は生体活動・維持に重要な様々なシグナルを誘導する。小胞体からの Ca2+ 放出には、K+チャネル（TRIC）によるK+の小胞体内への取り込みが必須であることが報告され、小胞体膜を介したK+輸送の重要性が明らかとなった。しかし、小胞体-細胞質間のK+濃度勾配の回復や維持には、K+チャネルにより取り込まれたK+を再び細胞質へ放出する「K+汲み出しポンプ」が必要であると考えられるが、その分子実体は不明である。我々は、様々な細胞の小胞体に共通して発現する「ER-ATPase（論文発表前のため仮称）」がK+-ATPase（K+ポンプ）として機能することを見出し、K+汲み出しポンプの実体である可能性が示唆された。
本研究は、(1)ER-ATPaseの小胞体におけるK+汲み出し機構およびその制御メカニズム、(2)小胞体Ca2+シグナリングにおける生理的意義、(3)ER-ATPaseの機能破綻による病態発症機構の解明を目的とし、K+ポンプの関与する小胞体Ca2+シグナリング制御機構という新規概念の実証を目的とする。
前年度の研究において、小胞体膜においてK+-ATPaseとして小胞体から細胞質へのK+放出を担っていること、またその機能が小胞体のCa2+貯蔵レベルおよび放出能に関与している可能性が明らかとなった。本年度は、（1）ER-ATPaseの機能を阻害もしくは活性化する化合物の探索、（2）ER-ATPaseと分子会合もしくは機能連関する分子の探索および機能解析、（3）筋小胞体におけるER-ATPaseの発現および機能について検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
HEK293細胞におけるER-ATPase発現系を用いて、ER-ATPaseのATPase活性に効果を示す薬物のスクリーニングを行ったところ、胃プロトンポンプ（H+,K+-ATPase）阻害剤がER-ATPase活性を有意に抑制することを見出した。そのIC50値はH+,K+-ATPaseに対するIC50値と近似していた。H+,K+-ATPaseのK+結合部位および阻害剤の結合部位から推測された点変異体を種々作製しER-ATPase活性に対する影響を検討することでER-ATPaseのK+結合部位および胃プロトンポンプ阻害剤結合部位を明らかにした。また、プロテオーム解析よりER-ATPaseと機能連関する分子として、ミトコンドリア外膜タンパク質を見出した。現在両者の機能的関連性について詳細な検討を行っている。さらに、ウサギ骨格筋から調製した筋小胞体において、ER-ATPaseが発現していること、プロトンポンプ阻害剤で抑制されるER-ATPase活性の特性と類似したATPase活性が存在することを見出した。本年度の研究より、ER-ATPaseの阻害剤および関連分子の同定に成功したことから、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
下記の研究を行い、ER-ATPaseの小胞体における生理機能およびその発現および機能破綻が引き起こす病態生理機能の全容解明を目指す。（1）ER-ATPaseとミトコンドリア外膜タンパク質との機能連関の解明：ER-ATPaseとミトコンドリア外膜タンパク質の共発現系およびノックダウン（アウト）系を作製し、両者の分子会合、機能的関連性、機能連関が小胞体やミトコンドリアの局在や機能に与える影響について詳細に検討する。(2) ER-ATPaseノックアウト細胞もしくはマウスを作製し、フェノタイプ解析を行う。特に、小胞体の形態や機能異常および小胞体ストレスとの関連性に着目する。また、Ca2+シグナル関連タンパク質やミトコンドリア外膜タンパク質の発現や機能の変化について解析する。(4) ER-ATPaseの機能異常とヒトにおける病態との関連性の解明：上記研究において関連が示唆された疾患を罹患している患者の組織や細胞の単離、および初代培養細胞の作製を行い、ER-ATPaseの発現や機能の異常を検討する。また、がんを含めた関連疾患のヒト組織アレイを用いて、多検体の各種疾患患者の正常および病態組織におけるER-ATPaseの発現レベルおよび局在を検討し臨床データとの相関を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
少額の次年度使用額が生じたが、次年度に使用し、今後も当初計画通り研究
を進める。
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