| 研究課題/領域番号 |
20K07279
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| 研究機関 | 国際医療福祉大学 |
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研究代表者 |
相馬 義郎 国際医療福祉大学, 薬学部, 教授 (60268183)
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| 研究分担者 |
内橋 貴之 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (30326300)
古田 忠臣 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (10431834)
中川 大 中部大学, 応用生物学部, 准教授 (40397039)
岩本 真幸 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (40452122)
大崎 寿久 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所, 人工細胞膜システムグループ, サブリーダー (50533650)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 膜蛋白複合体 / 抗原ー抗体反応 / 分子間相互作用 / １分子直接観察 / 高速原子間力顕微鏡 / CFTR / 嚢胞線維症 |
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| 研究実績の概要 |
膜蛋白およびそれらの高次機能複合体の動作機構の解明は、医学生理学の大きな進歩に繋がると期待されるが、細胞生理学、生化学および免疫組織学的な研究が中心であり、その分子レベルでの詳細な動作メカニズムについては、ほとんど解っていない。最近、大きく発展したクライオ電子顕微鏡（クライオEM）法によって得られる立体構造は、ある条件下における平均化構造（スナップショット）に過ぎず、それらは膜蛋白の機能発現の理解への重要な第一歩ではあるが、その全体的な理解にはまだほど遠いものがある。
研究代表者は、現在までの高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を用いた抗原-抗体反応や膜蛋白１分子から膜蛋白複合体までの分子レベルでの直接観察を行なってきた。特に抗原-抗体反応においては、高速AFMで観察された１分子レベルでの抗原と抗体の結合・解離動態とELISAでの巨視的レベルでの結合・解離情報の間に無視できない相違が認められたことから、分子レベルと巨視レベルとの間のメゾスコピックな領域における分子間相互作用に関する未知の分子動態プロセスの存在の可能性に気づいた。
さらに、１分子の動態観察においては、嚢胞線維症原因遺伝子産物であるCFTRチャネルの細胞内側にあって、CFTRのATP依存性ゲーティングに中心的な役割を果たしている２つのNucleotide Binding Domain (NBD1&2)が、２量体形成と解離という２つの状態を単に直線的に行き来するのではなく、大きくランダムに「ゆらぐ」なかで機会的に会合して２量体を形成している可能性を指摘した。
分子の「ゆらぎ」は、CFTRの機能発現のみならず、遺伝疾患嚢胞線維症の原因である病因性変異によるCFTRの細胞膜上発現障害の病態メカ二ズムに深く関わっていることを明らかにしつつある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
まず最初に、高速AFMを用いて、本研究における標的分子のひとつであるCFTRのATP依存性チャネルゲーティング機能に重要な働きをしている細胞内側にある２つのNBDが、大きくランダムに揺らいでいることを明らかにした。
一方、嚢胞線維症の分子病態メカニズムとして、病因性変異によってNBD1の構造が不安定になったり、他のドメインとの相互作用が不安定になると、分子全体が不安定になり、ゴルジでの糖鎖修飾が行われないまま、分解されてしまうクラスⅡ変異がある。研究代表者らは、日本人患者に見つかった22種類のCFTR変異からクラスⅡ変異10種類を特定し、そのうち5種類は、主要白人型クラスⅡ変異体ΔF508を安定発現させる目的で開発された発現補正薬lumacaftorによって安定発現されることを明らかにした。さらに、日本人で２番目と３番目に多いL441P変異およびH1085R変異体が、lumacaftor (VX-809)に加えて、最近開発されたelexacaftor (VX-445)によって相乗的に安定発現することも発見した。
高速AFMの1分子動態の動画データを正しく理解し、病因性変異がCFTR分子に与える不安定性を分子の揺らぎとして捉えて定量的に解析するためには、分子動力学(MD)シミュレーションが必要となる。クラスⅡ変異において重要であるNBD１のMDモデルを作成し、NBD1に存在する５つの日本人病因性変異L441P、Y517H、L548Q、I556V、L571Sのドメインの揺らぎに与える影響をシミュレートした。さらに、NBD1にそれを結合支持している2つの細胞内ループ Intracellular loop(ICL1&4)を加えた全細胞内ドメイン構造のMDモデルを作成した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．一分子ゆらぎのMDシミュレーション
まず最初に、直近に完成した全細胞内ドメインMDモデルを用いて、ICL４に存在するH1085R変異のCFTR細胞内ドメインの揺らぎに与える影響をシミュレートし、H1085R変異のクラスⅡ発現障害メカニズムを明らかにする。
次に、CFTR分子全体をリン脂質二重膜に組込んだ生理的条件下でのMDシミュレーションを行なって、クライオEMで得られた凍結構造から、実際に機能している状態でのCFTRの分子構造を引き出す。2022年1月に発表されたlumacaftorが結合した状態でのCFTRの凍結構造を用いて、lumacaftorが病因性変異体CFTRの揺らぎに与える影響を調べて、CFTRのクラスⅡ発現障害における分子揺らぎの変化、そして補正薬の作動メカニズムを明らかにする。また、高速AFMで得られる数十ms～数sにまでおよぶタイムスケールでの揺らぎを解析するためにMartini粗視化モデルの開発を目指す。
２．日本人病因性変異体CFTRの分子病態生理学
本研究において白人種に多く見られるΔF508変異体の発現補正薬、lumacaftor やelexacaftor が、L441PおよびH1085Rをはじめとする日本人の変異体の安定発現に効果があることを明らかにしてきた。しかしながら、これらの変異点はお互いに大きく離れており、同じ補正薬が効果を示すメカニズムは不明である。しかしながら、これらの日本人変異もΔF508変異に似た不安定化やゆらぎの変化に深く関連した分子病態メカニズムを持っていると考えられる。今後は、これら日本人変異CFTRの発現補正薬および活性増強薬の研究を進めていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
分子動力学シミュレーションに関する共同作業を行なっていた研究分担者との作業の一部を、新型コロナウイルス感染症緊急事態宣言の影響によりオンラインで行なったため、本年度予算の一部を次年度に使用することにした。
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