| 研究課題/領域番号 |
20K07284
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| 研究機関 | 生理学研究所 |
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研究代表者 |
下村 拓史 生理学研究所, 分子細胞生理研究領域, 助教 (50635464)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | イオンチャネル / 非天然アミノ酸 / 光生理学 / 電気生理学 / 膜タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、コドン拡張法を利用して光架橋性非天然アミノ酸（pcUAA）をイオンチャネルに導入することで、特定の状態を “狙って”機能・構造解析することを目的としている。pcUAA導入体は光照射によりその状態を“固定化”することができるので、膜電位依存性K+チャネルであるKv1.2を対象とし、異なる膜電位刺激とあわせて光照射を行うことで、新たな構造・機能についての知見を得ることを狙う。昨年度までに、卵母細胞におけるpcUAA導入系を確立し、pcUAA導入Kv1.2変異体のうちで紫外光照射により活性が減少するものを同定した。
本年度は発現系の最適化を行うとともに、pcUAA導入位置のスクリーニングを行った。pcUAA導入時の各種条件を最適化し、経済的かつ効率的にpcUAA導入体を得る方法を最適化した。また、S4ヘリックス上の複数の箇所をアジドフェニルアラニン（AzF）および、パラベンゾイルフェニルアラニン（pBpa）をtagコドンに置換したヒトKv1.2変異体を作製した。これらの変異体プラスミドとともに、AzFあるいはpBpa用のtRNA/アミノアシルtRNA合成酵素をコードするプラスミドを、卵母細胞核に注入した。二電極膜電位固定法により、チャネル活性を確認できたものについて卵母細胞に紫外光照射を行い、チャネル活性に変化があるかどうかを確認することで、光架橋の可能性を検討した。複数の変異体をスクリーニングした中で、最も効果的に架橋形成を引き起こす導入位置を見出した。また、この変異体については光架橋効率に電位依存性があることもわかり、機能・構造解析に適していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度はpcUAA発現系の最適化を試みるとともに、S4に網羅的にpcUAAの導入を行い、高効率に光架橋を起こす残基の同定を試みた。pcUAA発現系の最適化については、まず、卵母細胞への直接注入、あるいは培地添加のいずれかが適しているかを検討した。発現量としては卵母細胞への直接注入がより大きな電流が生じるが、二回の注入が必要になり細胞にダメージをより与えうる。一方、培地添加の場合では、測定に十分な発現が確認されること、また、光応答性の効率の観点からも有効であることがわかった。さらに、卵母細胞の動物極側と植物局側のどちらから紫外光を照射するべきかなどの照射方向依存性についても検討を行った。以上の検討の結果、効率的に光依存性を確認する方法を確立した。
S4ヘリックスの網羅的なスクリーニングの結果、光感受性を示したAzFおよびpBpF導入体のうち最も素早く電流が変化するものを高効率で光架橋が形成される変異体として同定した。この速さはpcUAAと周囲の架橋対象が最適な位置にあることを反映していると考えられ、特定の状態の構造を歪めることなく捉えられる可能性が高いと考えている。また、この変異体については光照射を異なる電位の保持と同期して行った場合、特定の電位の時に電流減衰が早いことがわかった。これも状態を捉えるのに有効な特性であると期待される。以上のように、適した変異体がえられつつあり、計画は順調に進展しているものと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
さらに最適な変異体を探索するため、電位センサー内部のS4ヘリックスを取り囲むアミノ酸残基への導入も検討する。また、生化学的手法により、実際にpcUAAに由来する化学架橋が形成されることで活性の変化が生じていることを確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は発現系の最適化、各変異体を作製するためのコストの効率化を図るなどして、より少ない経費で結果を得られた。このため次年度は、より精密に実験を進めるための物品費や、高効率に光照射が可能な機器の購入を検討する。
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