研究課題
尿細管上皮細胞の増殖・分化メカニズム解明を目指すにあたり、R4年度に新たな実験モデルとしてzVHL-KOおよびdre-mir-210-KOゼブラフィッシュを樹立している。今年度、これらを交配しダブルKOを得て、表現型の観察を開始した。受精後8日目までにVHL-KOとダブルKOにおいて浮腫が観察され、ダブルKOにおいて浮腫がより強い傾向があった。浮腫の出現は腎機能低下を示唆しており、miR-210欠失は腎機能に影響を与えうると考えられた。また浮腫が強くなるにつれて組織中の乳酸量が増加した。これは解糖系が亢進していることを示しており、miR-210欠失がミトコンドリアのエネルギー代謝に影響を及ぼしたと考えられた。また、受精後8日目の稚魚について電子顕微鏡により尿細管上皮細胞を観察すると、浮腫が強い個体では尿細管上皮の壊死が観察された。微絨毛の消失、ミトコンドリアの減少が認められ、管腔には円柱様のものが認められた。このような個体はほぼダブルKOであり、miR-210欠失が尿細管上皮への障害を増悪していると考えられた。
3: やや遅れている
新たに実験モデルとして追加したゼブラフィッシュについて、昨年度樹立したzVHL-KOとdre-mir-210-KOを交配し、ダブルKOの表現型の観察を開始した。ダブルKOにおいて、zVHL-KOに比べて浮腫などの表現型が増悪される傾向があった。電子顕微鏡による尿細管上皮細胞の微細構造の観察、網羅的発現解析、GC-MS/MSによる代謝産物の網羅的解析を実施し、これらの結果からダブルKOにおける表現型の増悪を説明できるシグナル経路、代謝経路があるのか変動しているものを検索している。今年度の計画は順調に進んだ。しかしR3年度において、大学による改修工事に伴って所属講座の実験室が閉鎖となり、実施可能な実験が制限されるなど実験を実施する時間が著しく減ったことから、全体の計画としてはやや遅れが出ている。
今年度は、VHL-HIF-miR-210経路において、miR-210が欠失することによる表現型の一端を見つけることができた。また網羅的発現解析、GC-MS/MSによる代謝産物の網羅的解析を実施した。今後は、これら網羅的解析のデータを用いて、表現型を説明できるような変動がみられているのかを検討する。また、近位尿細管上皮細胞の分化や増殖に変化がみられるか、ネフロンマーカーを発現するCdh17-GFPゼブラフィッシュとの交配や、分化マーカーや増殖マーカーの免疫染色により調べる。また、網羅的解析において変動したシグナル経路、代謝経路について、作動薬や阻害剤を用いて表現型が軽減される、あるいは増悪するなどの変化がみられるか調べる予定である。
R3年度、大学による改修工事に伴って所属講座の実験室が閉鎖となり、実施可能な実験が制限されるなど実験を実施する時間が著しく減ったことで、以降の計画に遅れが出ていた。R5年度の研究計画については、新規モデルのゼブラフィッシュについてダブルノックアウトの表現型の観察を開始し、網羅的解析を実施するなどほぼ順調に進んだが、R3年度での遅れを取り戻すまでには至っていない。よってR3年度からの繰り越し分もあってR5年度で使用しきれず、次年度使用額が生じた。次年度はダブルKOゼブラフィッシュにおいて尿細管上皮細胞の分化・増殖について免疫染色や電子顕微鏡を用いた観察を計画しており、染色のための試薬、抗体、ガラス消耗品などの購入に使用する。また、網羅的解析において変動したシグナル経路、代謝経路に関する作動薬、阻害剤を購入する予定である。
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Cancer Science
巻: 114 ページ: 4459～4474
10.1111/cas.15942
Cancers
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