| 研究課題/領域番号 |
20K07473
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立国際医療研究センター |
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研究代表者 |
安田 加奈子 (駒木加奈子) 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 研究員(移行) (50415551)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | マラリア原虫 / 転写因子 / 転写調節 / ChIP-Seq / レポーターアッセイ |
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| 研究実績の概要 |
マラリア原虫赤血球内寄生期の厳密な遺伝子発現制御機構は、それを担う転写因子の正体を含めて詳細がわかっていない。申請者は熱帯熱マラリア原虫の赤血球内寄生期のトロホゾイト期に特異的に発現する遺伝子pf1-cys-prxのプロモーターに作用して転写活性化する因子PREBPを同定、更にバイオインフォマティクス解析にてPREBPと類似構造を持つ新規因子Aを同定した。PREBPと因子Aは赤血球内寄生期の原虫細胞内の核局在のタイミングが異なり、それぞれが転写制御をおこなう時期の違いを反映していると考えられ、また、この細胞内局在時期の調節は時期特異的な発現制御の根幹となるメカニズムであると考えた。本申請研究ではPREBPと因子Aについて、i)因子の細胞内局在を調節するタンパク質修飾の詳細、および、ii)因子が発現制御する遺伝子のプロモーターに共通するモチーフを明らかにし、マラリア原虫赤血球内寄生期の細胞周期進行を支える転写制御機構の解明に迫ることを目的とする。
本年度は上記のii)について解析するために、PREBPが染色体上でどの遺伝子群の5’に結合しているのかをクロマチン免疫沈降と次世代シーケンサーによる網羅的ChIP-Seqによって解析し、その候補遺伝子群を明らかにした。現在は、これらの候補遺伝子が実際にPREBPによる制御を受けているのかを明らかにする目的で、候補遺伝子約40種類のプロモーターそれぞれの下流にルシフェラーゼ遺伝子を接続したプラスミドベクター、また同じプラスミド上にPREBPの発現カセットを挿入したプラスミドベクターの作成を進めている。できたものからレポーターアッセイをおこなう予定であり、候補遺伝子の絞り込みをおこなっていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度はChIP-Seqにより、PREBPによる制御を受けている因子群をある程度絞り込むことができたので、着実に進展はしている。しかし、新型コロナウイルス感染症流行の影響にて、研究所に出勤できない期間があったために予定していた実験を進められないところもあった。予定では因子AについてもChIP-Seqをおこなう予定であり、また、さらにPREBPによる制御を受けている因子の候補を絞り込むレポーターアッセイまではできている予定であった。また、研究計画にあった、PREBPのタンパクの修飾に関する解析にも着手できていないので、「やや遅れている」との自己点検結果に至った。
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| 今後の研究の推進方策 |
PREBPの候補遺伝子の絞り込みまではできているので、今後はレポーターアッセイによって本当にPREBPによる発現の調節を受ける遺伝子群を特定する。これらの5’の配列についての解析結果から、各転写因子の結合モチーフを明らかにする。 また、PREBPのみでなく、因子Aについても同様の解析を進める。この解析の予測される成果として、PREBPおよび因子Aによってどの様な遺伝子群の発現が制御されるかが明らかとなることがあげられる。その仮説としてはⅰ) 細胞周期に依存して発現のタイミングを同じとする遺伝子群、ⅱ) 生物学的に同じ機能（例：抗酸化系など）に関わる遺伝子群、 ⅲ) 同一染色体上で核内の特定の位置に配置される遺伝子群、等を想定している。
PREBPおよび因子Aの機能を調節するタンパク修飾についても解析を進めていく。これまで原虫細胞内のPREBPについて特異的抗体を用いたウエスタンブロットによって解析した結果、移動度の異なる２本のバンドが観察されていた。移動度の少ないバンドの方が、多く核内に局在する傾向があることから、この泳動度の違いはなんらかのタンパクの修飾を示唆し、また、この修飾はPREBPの細胞核内局在を制御している可能性がある。また因子Aも修飾による核移行制御を受けている可能性がある。これら修飾の正体を明らかにする為に以下の実験をおこなう。1)既に作成した、GFP融合因子発現原虫を材料に、核抽出物、細胞質画分を材料に抗GFP抗体を用いた免疫沈降をおこない、沈降産物をSDS-PAGEによって展開した後に、抗リン酸化抗体、抗ユビキチン化抗体、抗アセチル化抗体を用いたウエスタンブロットによって沈降産物の検出を試み、これらの修飾があるかを調べる。2)さらに免疫沈降産物を質量解析することによって、タンパク質のプロセッシングの有無、アミノ酸修飾の種類、それらの部位を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症の流行により、実験室に来られる機会が減ったことにより、実験のための消耗品の購入が予定よりも減った。また、新型コロナウイルス感染症の流行の影響によって、購入を希望する消耗品（プラスチック製品）などがそもそも納入されないことがあった。
次年度以降は、前年度に予定していた実験も含み、遂行する予定であり、順次必要な消耗品を購入していく。
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