| 研究課題/領域番号 |
20K07474
|
|---|
| 研究機関 | 千葉大学 |
|---|
研究代表者 |
清水 健 千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (70312840)
|
|---|
| 研究分担者 |
濱端 崇 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 細菌感染研究室長 (40311427)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | 腸管出血性大腸菌 / O157 / 生体防御機構抵抗因子 / 一酸化窒素 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究の目的はEHEC特異的な未知生体防御機構抵抗因子を特定して、詳細な機能解析を行うことである。EHECを含めた大腸菌にはNOの殺菌効果を減弱させる３種類のNO消去酵素が存在する。これら３種類以外にEHEC特異的な生体防御機構抵抗因子を明らかにするために、EHECの標準株であるO157 Sakai株を用いて３種類のNO消去酵素遺伝子を欠失したEHEC変異株を構築し、このゲノムDNAを用いてプラスミドライブラリーを構築した。これを非病原性大腸菌BL21株由来の３種類のNO消去酵素遺伝子を欠失した大腸菌変異株に形質転換した。この大腸菌ライブラリーを嫌気条件と微好気条件においてNO処理を行い、生き残ったクローンを回収するためにLB平板に広げた。このスクリーニングを３ー4回行って、NOストレスに耐性のクローンを濃縮する。濃縮されたクローンが保持するプラスミドのインサートDNAをPCRで増幅し、塩基配列を決定した。その結果、28クローンのインサートDNAのうち、３カ所のDNA領域が複数のクローンに存在していた。また、この領域が機能的であるかどうかを確認するために、個々のクローンのNO耐性が上昇しているかどうかを嫌気条件と微好気条件で確認した。その結果、複数のクローンに置いて、コントロールプラスミドを保持しているクローンよりもNOに対して抵抗性を保持した陽性クローンを得ることができた。現在、それらの陽性クローンの責任領域を明らかにしているところであり、その領域の存在する遺伝子を特定することを試みている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までに、EHECの標準株であるO157 Sakai株を用いて３種類のNO消去酵素遺伝子を欠失したEHEC変異株を構築し、このゲノムDNAを用いてプラスミドライブラリーを構築した。そして、NO抵抗性のクローンのスクリーニングにも成功しているため。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後はこのEHEC特異的な生体防御機構抵抗因子の機能解析を行うとともに、EHEC内での広がりについても解析する予定である。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
研究代表者と研究分担者が進めていた研究を一時中断して、スクリーニングの方法を再検討した。このことによって今年度の研究費の使用を控え、再検討結果によってスクリーニングを再度行うことを考えていた。このために次年度使用額が生じた。しかし、再検討によってこの問題も解決したので、次年度使用額も使って研究を進めることができる。
|
