| 研究課題/領域番号 |
20K07480
|
|---|
| 研究機関 | 広島大学 |
|---|
研究代表者 |
加藤 文紀 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (70452589)
|
|---|
| 研究分担者 |
岡 広子 広島大学, 医系科学研究科(歯), 主任特任学術研究員 (60452588)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | 黄色ブドウ球菌 / トキシン・アンチトキシン / 生育阻害 / 膜タンパク質 / 酸化ストレス |
|---|
| 研究実績の概要 |
トキシン・アンチトキシン(TA)システムは、ほぼ全ての細菌が保有するシステムであり、細菌自身の生存に必須な細胞機能を停止させる事で、細胞分裂の停止および細胞死を誘導するトキシンと、そのトキシン活性を中和するアンチトキシンから成る機構である。染色体上に存在するTAシステムは、細菌のストレス応答、ファージからの防御、病原性、バイオフィルム形成、薬剤感受性や薬剤抵抗性に関与すルことが報告されている。本研究では、我々が新規に見出した黄色ブドウ球菌のTsaA/TsaT TAシステムがどのような機構で黄色ブドウ球菌に細胞死を誘導するのか、および黄色ブドウ球菌においてどのような生理的な役割を有するのか、特に抗菌薬作用時におけるパーシスター形成と酸化ストレスとの関連を解明することを目的としている。
当該年度は、黄色ブドウ球菌におけるTsaA/TsaT TAシステムの遺伝子欠損株および遺伝子過剰発現株を用いて、RNAseq解析による網羅的発現比較解析、種々の表現型解析、およびバイオインフォマティックス解析により、生理的な役割の解明を試みた。加えて、国際共同研究機関である米国・ラトガース大学にて研究滞在し、黄色ブドウ球菌細胞内でのTsaAアンチトキシンタンパク質とTsaTトキシンタンパク質との相互作用解析によりアンチトキシンがトキシン活性を中和する機構の解明、およびTsaA/TsaT遺伝子欠損株を用いた各種薬剤抵抗性・抗菌薬作用時のパーシスター形成の解析を実施した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
当初の計画では、黄色ブドウ球菌のTsaA/TsaT TAシステムの遺伝子欠損株および遺伝子過剰発現株を用いて黄色ブドウ球菌における生理的な役割の解明することを予定していた。現在までのところ、RNA seq解析および種々の表現型解析から顕著な変化を見出せていないが、生理的な役割を示唆する結果として、バイオインフォマティクス解析からTsaA/TsaT遺伝子のゲノム配列周辺遺伝子群に酸化ストレスに応答する遺伝子が存在することを見出し、TsaTトキシンと酸化ストレス応答との関連を支持した。また、本研究において対象としているTsaA/TsaT TAシステムは両タンパク質とも膜タンパク質であると推定されており、既知のTAシステムには無い特徴を有していることから、黄色ブドウ球菌の細胞膜上で両タンパク質が相互作用していることを明らかにすることを試みたが、水に不溶である膜タンパク質同士が複合体を形成した状態で可溶化させる条件検討に苦労しており、現在まで明確な結果を得られていない。問題解決のために今後は人工膜状でのタンパク質ータンパク質間相互作用解析または、化学的にタンパク質ータンパク質間をクロスリンクさせる処理をして解析を行うことで、TsaAアンチトキシンとTsaTトキシンが細胞膜上で相互作用をすることでトキシン活性の中和が行われていることを解明する。
|
| 今後の研究の推進方策 |
当初の研究計画から遅れていることから、補助事業期間を延長して黄色ブドウ球菌のTsaA/TsaT TAシステムによる細胞分裂・細胞死制御機構および生理的な役割の解明を試みる。TsaAおよびTsaTの両タンパク質とも水に不溶な膜タンパク質であり、黄色ブドウ球菌細胞の細胞膜上で機能していると推定されることから、タンパク質ータンパク質複合体形成の検出ができていない。問題解決のため、当初の計画に加えて黄色ブドウ球菌細胞内で人為的に発現させ、化学的にタンパク質ータンパク質間でクロスリンクさせた状態で、TsaTタンパク質およびTsaAタンパク質に結合するタンパク質を解析することで、TsaTトキシンがトキシン活性を示す機構およびアンチトキシンがトキシン活性を中和する機構を解明する。また、これまでに遺伝子欠損株および遺伝子過剰発現株を用いてTsaA/TsaT TAシステムの生理的な役割の解明に至っていないことから、当初の計画に加えてTsaT遺伝子に蛍光タンパク質またはFLAGタグを融合させレポーターアッセイにより、黄色ブドウ球菌細胞内でTsaTトキシンが発現する生理的な条件を探索する必要がある。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画していたアンチトキシンとトキシンの両タンパク質の相互作用解析およびトキシン活性と酸化ストレスとの関連解析の条件検討に想定以上の時間を要しており、補助事業期間を延長し翌年度も継続して研究解析を遂行する。
|
