| 研究課題/領域番号 |
20K07485
|
|---|
| 研究機関 | 北里大学 |
|---|
研究代表者 |
桑江 朝臣 北里大学, 感染制御科学府, 准教授 (60337996)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | ボルデテラ属細菌 / III型分泌装置 / エフェクター |
|---|
| 研究実績の概要 |
百日咳菌を含むボルデテラ属細菌はIII型分泌装置と呼ばれる病原因子を分泌するシステムを有している．菌はIII型分泌装置を経由して，菌体内で産生したエフェクターと呼ばれるタンパク質群を宿主である哺乳類細胞の細胞質に直接注入する．宿主細胞質内に移行したエフェクターは宿主細胞内因子との相互作用を介して宿主細胞内のシグナル伝達経路の活性化あるいは阻害を誘導することにより宿主の生理機能を撹乱し，感染成立に重要な役割を果たしている．本研究課題ではボルデテラ属細菌のエフェクターの１つであるBteAと呼ばれるタンパク質の機能を分子レベルで明らかにし，百日咳菌の感染機構の解明を通して新規薬剤開発の標的探索の基盤を構築することを目的としている．BteAは658アミノ酸からなるタンパク質で宿主細胞内に移行した後に，宿主細胞にネクローシス様の細胞死を誘導する．この細胞死はアクチン重合依存的に誘導されることが我々の研究によって明らかになっているが，BteAと相互作用する宿主側の因子や宿主細胞内でBteA依存的な細胞死に関与するシグナル伝達経路などは不明であった．酵母を用いたtwo-hybrid試験により，アクチン重合に関与する一連のタンパク質群が同定できた．BteAとGFPの融合タンパク質をコードするプラスミドを導入したCos7細胞やヒト肺上皮由来のA549細胞を用いてBteAと相互作用すると考えられたタンパク質の免疫蛍光染色を行ったところ，BteAと一部で共局在することが明らかになった．またこれらのタンパク質とBteAの相互作用を解析するために，BteAの全長658アミノ酸および数種類の部分欠失変異体を大腸菌より精製し，プルダウン試験を行ったところBteAのN末端側の領域が相互作用に重要であることが明らかになった．現在，これらのタンパク質が細胞死にどのような役割を果たしているか解析中である．
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ボルデテラ属細菌が産生するBteAと呼ばれるタンパク質が宿主細胞内でどのような因子と相互作用するか，またその相互作用を通してどのようなシグナル伝達経路を活性化あるいは阻害して最終的に細胞死を誘導しているのか解析を行っている．BteAが相互作用すると考えられる宿主細胞側のタンパク質を同定し，実際にそれらのタンパク質とBteAが宿主細胞内で共局在すること，またプルダウン試験により試験管内で結合することが示されている．今回，BteAの様々な部分欠失変異体を用いることによってこれらの相互作用がBteAのN末端側の領域を介して行われることが明らかになり，相互作用の特異性が示されたと考えている．またtwo-hybrid試験では同定されなかったタンパク質との相互作用の可能性も示されており，それらのタンパク質との宿主細胞内における共局在なども一部で認められている．またBteAの宿主細胞内移行についてボルデテラ属細菌のエフェクターであるBopNの関与を我々は報告している．最近の実験結果により，BopNによる BteAの宿主細胞内移行促進に関与する BteA内の領域を同定しつつある．さらに宿主細胞内に移行したBteAとBopNは相互作用し，この複合体が宿主細胞内でなんらかの役割を果たしていることが示唆されている．
|
| 今後の研究の推進方策 |
BteAが相互作用する宿主細胞側因子の候補は同定できたが，これらのタンパク質がBteA依存的な細胞死の誘導にどのように関与しているかは不明である．実際にアクチン重合依存的な細胞死に関する報告はほとんど存在せず，BteAによって誘導される細胞死に関与する哺乳類細胞のシグナル伝達経路は新規なものである可能性がある．BteAによって活性化あるいは阻害される哺乳類細胞内のシグナル伝達経路を明らかにするために，RNA-seqを用いた解析を行う予定である．具体的には哺乳類細胞に野生型のボルデテラ属細菌とBteAを欠損する変異株を感染させ，経時的にRNAを調製して野生株の感染時と変異株の感染時で哺乳類細胞内のRNAがどのように変動するのかを解析する．その他の手法としてCRISPR-Cas9系を用いてBteAによって制御されるシグナル伝達経路の同定を試みる．具体的にはマウスのgRNAライブラリーを有するレンチウイルスベクター粒子を調製し，マウスマクロファージ由来のRAW264.9細胞に感染させる．その後，すべての細胞がBteA依存的に死滅する条件でボルデテラ属細菌を感染させる．生き残ってきた細胞に対して，再度ボルデテラ属細菌を感染させ，さらに生き残ってきた細胞を取得する．これらの生き残ってきた細胞内で破壊されている遺伝子を解析し，どのようなシグナル伝達経路に関与する因子をコードしているのか明らかにする．またBteAと相互作用すると考えられた因子についても，CRISPR-Cas9系を用いて遺伝子を破壊し，それらの細胞に対してボルデテラ属細菌を感染させ細胞死の誘導効率を計測する．
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
購入を考えていた抗体について実験の進捗状況が追いつかず，次年度に購入することを考えたため予算の使用額が予定より下回った．今年度は予定していた抗体を購入するための費用に当てる予定である．
|
