| 研究課題/領域番号 |
20K07491
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| 研究機関 | 産業医科大学 |
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研究代表者 |
福田 和正 産業医科大学, 医学部, 准教授 (40389424)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 新規感染性微生物 / 呼吸器感染症 / ゲノム解析 |
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| 研究実績の概要 |
IOLA (Infectious Organism Lurking in human Airways)は、申請者らが慢性下気道感染患者由来の気管支洗浄液（BALF）検体から発見した新規細菌である。IOLAは細菌感染症患者から有意に検出され、病原性を有する可能性が示唆されるが、未だに分離培養が成功しておらず、その性状はほとんど不明である。IOLAの培養法を確立し、生きた状態での性状解析は、原因が明らかでない様々な呼吸器疾患へのIOLAの関与を解明するために必須である。
IOLA感染実態と遺伝的多様性の解明のため、鼻汁症状を呈する小児から吸引採取した鼻汁（採取後-80℃で凍結保存）からDNAを抽出し、IOLAの16S rDNA特異的nested-PCRを行った。昨年度からの累計で1,440検体をスクリーニングし、合計91のIOLA陽性検体を得た。約1,200bpのIOLA 16S rDNAの系統解析を行った結果、新たに得られた配列は、これまでに明らかにした5つの配列系統のいずれかに属し、IOLAには種のレベルで異なる可能性がある5つの分類群が存在することが明らかになった。本年度は呼吸器疾患患者のBALF385検体（採取後-80℃で凍結保存）に対するスクリーニングも行い、さらに７検体のIOLA陽性検体を得た。このBALF由来のIOLA16S rDNAは、これまでBALFで検出されてきた１系統（Type 1）以外のIOLA系統（Type 3）が２検体から検出され、Type 3系統のIOLAもヒトの下気道に感染する可能性があることが示唆された。また、IOLA陽性のBALF検体からメタゲノム解析により決定したIOLAゲノム情報から、IOLAはα-proteobacteria 綱のRickettsiales目に属する科のレベルで新規な細菌であることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2021年度は、新鮮な気管支洗浄液（肺炎患者）および小児鼻汁検体を採取してIOLA陽性検体のスクリーニングを行い、可能な限り新鮮な状態の検体を用いてIOLA培養法の検討を行う予定であった。しかし、新型コロナウイルス感染症が蔓延と収束を繰り返す中、検体の収集を控えざるを得ない状況が頻発した。そのため小児鼻汁検体の採取が予定通り実施できず、新鮮な鼻汁の供給が不可欠であるIOLAの培養法の検討には支障が生じた。そこで、これまでに採取して-80℃で保管していた検体（小児鼻汁480検体、および呼吸器疾患患者由来BALF385検体）を用い、DNAの抽出、IOLA特異的PCRを用いてIOLA陽性検体のスクリーニング、およびIOLA-16 SrDNA塩基配列に基づく系統解析を中心に実施した。その結果、累計９１検体の小児鼻汁、および７検体のIOLA陽性BALF検体を得た。小児鼻汁由来のIOLAは、5つの16S rRNA遺伝子配列系統から構成されることが明らかになった。これまでの解析では呼吸器疾患患者由来BALFからは１系統(Type 1)のみ検出されていたが、本年度得られたIOLA陽性BALF７検体から２検体Type3系統が検出され、Type1以外のIOLA系統のヒトの下気道感染症への関与ついて知見を得ることが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度の新型コロナウイルス感染症の状況に依存するが、今後も可能な限り検体の採取を行い、新鮮な状態のIOLA陽性検体を用いたIOLA培養法の検討を中心に研究を行う予定である。新鮮な検体の採取の目処が経たない場合は、これまでIOLAが検出された小児鼻汁および呼吸器疾患患者BALF（-80℃で保管中）を用いて、鼻腔上皮細胞との共培養におけるIOLA増殖の検討、および条件の確認を行う。IOLAの培養法の確立に成功した場合は、IOLAの細胞形態、宿主細胞内での局在部位、増殖速度、細胞障害性、保存方法（安定性）について検討する。また、培養が成功しない場合は、IOLA陽性検体からIOLAゲノムの濃縮・増幅を検討し、次世代型シークエンサーを用いてIOLAゲノム配列決定を行う。得られた配列を用いて全ゲノム配列に基づいた高精度系統解析を行い、IOLAの株間多様性を明らかにするとともに、疾患と関連するIOLA系統を同定し、その系統に特異的な遺伝学的特性を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2021年度中に、産業医科大学呼吸器内科を受診した呼吸器疾患患者のBALFおよび喀痰（約50検体/年）、および市中小児科クリニックを受診した鼻汁症状を呈する小児の鼻汁（約400検体/年）を検体として採取する予定であった。しかし、新型コロナ感染症の感染防止の観点から研究用検体の採取が困難となり、当初の予定より採取検体数が少なくなった。その結果、購入予定であった検体採取容器や、IOLA培養法検討のための培地や培養容器が予定よりかなり少なくなった。また、開催予定の学会が全てオンライン開催になり、予定していた旅費を使用する必要がなくなった。以上の理由により予算の使用計画に変更が生じた。繰り越された予算については今後のIOLA培養法の検討（検体採取容器、細胞用培地等の費用）、次世代シークエンサーを用いたIOLAのゲノムレベルでの多様性解析、およびオープンアクセスジャーナルへの投稿に関わる費用として使用する予定である。
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