| 研究課題/領域番号 |
20K07502
|
|---|
| 研究機関 | 新潟薬科大学 |
|---|
研究代表者 |
西山 宗一郎 新潟薬科大学, 応用生命科学部, 准教授 (30343651)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
|
| キーワード | 偏性嫌気性菌 / 走化性 / スポロゲネス菌 / ボツリヌス菌 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究では運動能をもつ偏性嫌気性菌Clostridium属細菌の走化性能の解析を目的としている．今年度もボツリヌス菌の類縁菌であるスポロゲネス菌を用い，走化性能の定量的解析系の開発を目指して研究を行った．昨年度は，標準培地を段階的に希釈することにより，走化性の指標としての菌のスウォーム能を観察できる培養条件を定めた．スウォームリングの歪みを計測することで誘引・忌避物質をスクリーニングしたが，合わせて計3種と，想定より種類が遥かに少ない問題があった．
このアプローチでは標準的な培地を開始点としたため，希釈したとはいえまだ栄養分が豊富すぎ，各種培地成分が雑駁すぎて焦点が絞れない問題があった．そこで今年度は合成最小培地からのアプローチを試みた．過去の論文の情報から最小培地を調製し，当研究室の保有する菌株であっても確かに増殖することを液体培地で確認した．しかしこの組成でスウォームプレートを調製しても菌は全く広がらずスウォーム自体を観察できなかった．その後の解析で運動性を示す菌が極端に低下していることが分かった．今までとは逆に栄養分があまりにも少なく，かろうじて増殖できるものの運動までエネルギーを回せていない可能性が考えられたため，候補物質を添加して運動の回復を試みた．検討した中では，アラニン添加でスウォームが回復した．そこでこのアラニン添加培地で改めて誘引・忌避物質のスクリーニングを行ったが，新たな誘引・忌避物質の検出には至らなかった．
ゲノムからのアプローチ（大腸菌再構成系の確立）については，スポロゲネス菌の走性受容体ホモログのセンサードメインと大腸菌のシグナル産生ドメインとのキメラ受容体を複数種構築して検討したが，いずれも激しい分解と封入体形成が見られ，走化性応答経路の再構成には至らなかった．
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
上述のように今年度試みた2つのアプローチについて，いずれも事前に想定したほどの成果を得られず，進捗はやや遅れていると判断した．スポロゲネス菌を用いた最初のアプローチでは，最小培地という，かろうじて生存・増殖ができる極めて厳しい条件の中で，今までは表面に出ていなかった問題（おそらくは酸化ストレス）が顕在化した可能性が高い．本課題研究で導入した嫌気グローブボックスを今後も積極的に用い，培地作製時や培養時に極力酸素が入らないよう，今まで以上に注意を払い研究を継続していく．後者のゲノムDNAを用いた大腸菌再構成系の構築については，今年度トライしたキメラ受容体では，複数試したものの大腸菌走化性受容体との切り替え部位に問題のある可能性があり，別の部位を検討していく．また進捗状況に応じて，大腸菌とのキメラではなくスポロゲネス菌由来の走化性受容体（全長）及び走化性因子の双方を導入した大腸菌再構成系の構築も視野に入れる．
|
| 今後の研究の推進方策 |
スポロゲネス菌をダイレクトに用いたアプローチについては，酸化ストレスを極力減らすようにあらゆる操作を工夫するとともに，より効率の良い運動回復を促せる添加物質の探索を行う．また平板作成に用いている寒天が滅菌時に酸化ストレス物質を生じるとする説もあるため，代替としてゲランガムを支持体とするスウォームプレートも並行して試す．このような試みは先行者が誰一人おらず，多くの条件検討を必要とすることが予想される．運動・応答についても好気条件での観察は酸化ストレスが非常に強いことから，嫌気条件で長時間観察できるよう系の改良を行う．いずれの場合も本研究課題で新規導入した嫌気ボックスを最大限活用する．ゲノムDNAを用いた再構成系の構築については，先述のように引き続きアプローチを継続し，切り替え部位の変更を行い検討を重ねていく．
一部難航しているところもあるが，嫌気性菌の走化性能についていくつかの知見が得られ，概要をかなり掴めてきたため，今年度からはボツリヌス菌についても研究を開始する．具体的にはまずゲノム方面のアプローチから始め，まずゲノムDNAの取得と走化性関連因子のクローニングから行う．スポロゲネス菌と大腸菌のキメラ走化性受容体について，機能するものを得られ次第，その知見をボツリヌス菌にフィードバックし，同種のキメラ受容体を構築する．前者のアプローチについては，スポロゲネス菌で誘引・忌避物質のスクリーニング系を確立できれば，ボツリヌス菌にフィードバックを掛ける．幸い両菌種は進化的に極めて近い位置にあり，実験プロトコールの改変は最小限で済むことが期待される．
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
スポロゲネス菌ゲノムを用いたアプローチにおいて当初計画よりわずかに遅れがあり，今年度の予定額のごく一部を次年度に繰り越すこととなった．繰越分は次年度の研究計画に基づき，遺伝子操作に必要なプライマー・酵素類の購入に充てる．
|
