| 研究課題/領域番号 |
20K07516
|
|---|
| 研究機関 | 長崎大学 |
|---|
研究代表者 |
櫻井 康晃 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助教 (00818338)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | CCHFV / シュードタイプウイルス / 複数のウイルス株 / 膜融合 / 抗血清 / ダニ |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究では、最近我々が開発した水疱性口炎ウイルス（VSV）由来の粒子核とクリミア・コンゴ出血熱ウイルス（CCHFV）由来の表面糖タンパク質を持つシュードウイルスを用いて、細胞侵入過程を要因とする病原性発現機序を解明することを目指す。その中で2021年度は昨年度に引き続き、種々のウイルス株由来の表面糖タンパク質を持つシュードウイルスを作製し、それらの感染効率の違いを決定するウイルス側の要因を同定することを目標としていた。
既にクローニング済みであったHoti株やIbAr10200株由来の表面糖タンパク質に加えて、ダニから分離されたヒトに感染性を示さないMalko Tarnovo-BG2012-T1303株由来の表面糖タンパク質、及びCCHFVに近縁で人に病原性が無いハザラウイルス由来の表面糖タンパク質のクローニングも完了した。ヒトに対して病原性が低いAP92株由来の表面糖タンパク質のクローニングも現在実施中である。
また、細胞侵入過程をより詳細に解析するために、CCHFVの表面糖タンパク質を介した膜融合を定量するアッセイ系を開発した。本アッセイの最適化を行う過程において、膜融合が酸性pHの刺激により誘起されることが分かった。更に、シュードタイプウイルスの産生を飛躍的に促進したC末端欠損型の表面糖タンパク質を用いることで、本アッセイにおける膜融合の効率も飛躍的に向上することが認められた。
これまではCCHFVの表面糖タンパク質の発現確認が出来ていなかったが、IbAr10200の表面糖タンパク質由来のペプチドで免疫したウサギ由来の抗血清を用いた結果、ウェスタンブロッティング法によりHoti株及びIbAr10200株由来の表面糖タンパク質Gnの検出に成功した。シュードタイプウイルス産生細胞の培養上清でもGnが検出出来たことから、シュードタイプウイルスの産生が裏付けられた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2020年度に続き今年度もまた、年度を通して常に新型コロナウイルス対応を行っていたことにより、本研究に十分な時間を割くことが出来ず、当初計画していたウイルス株間の感染効率の違いを決定するウイルス側の要因を同定するには至らず、種々の細胞での検討も不十分である。しかし、ヒトへの異なる病原性や感染性を持つウイルス株由来の表面糖タンパク質のクローニングが進んでいることに加えて、表面糖タンパク質の発現確認やシュードウイルスの検出に必要な抗血清を入手し、膜融合アッセイも確立したことで、ウイルス株間での比較検討を詳細に行うための地盤は着実に出来ていると考えられる。また、昨年度までに開発したシュードウイルスを用いてCCHFVの新規侵入阻害剤を複数同定しているが、本研究で確立した膜融合アッセイ等を用いてより詳細な作用機序の同定にも成功しており、論文発表出来る形になりつつある。
以上より、新型コロナウイルス対応のために当初計画していた実験の多くを行うことは出来なかったが、本研究の目的を達成する上で重要な研究基盤の確立が着実に出来たため、本研究計画はやや遅れていると考えられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
まず、IbAr10200株やMalko Tarnovo-BG2012-T1303株由来の表面糖タンパク質を持つシュードタイプウイルスの作製方法の最適化を行う。それと並行して、低病原性のAP92株由来の表面糖タンパク質のクローニングとその後のシュードウイルスの作製も進める。必要であれば、その他のCCHFVのウイルス株由来の表面糖タンパク質についても検討する。それらを用いて、引き続き種々の細胞での感染効率を比較解析し、ウイルス株間で異なる感染効率を示す細胞種を同定する。最近、海外の細胞バンクよりダニ（CCHFVのベクターであるHyalomma anatolicumも含む）の細胞株を複数入手したため、それらについても併せて検討する。
その後、２種類（特に高病原性株と低病原性株の組合せ）のウイルス株由来の表面糖タンパク質元に種々のキメラタンパク質を作製し、それらを持つシュードウイルスの感染効率や膜融合の活性を上記で同定した細胞種において比較解析することで、感染感受性の違いを決定する表面糖タンパク質内の領域を同定する。更に、これまでに開発したシュードウイルスを用いたスクリーニング系を活用し、多数の標的既知の化合物のスクリーニングを行い、高病原性株と低病原性株由来のシュードウイルスの感染効率の違いを解消する化合物を同定する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックに対応するために、当該年度全体で関連研究や検査等を迅速に実施する必要があり、本研究に十分な時間と労力を割くことが難しかったため、次年度使用額が発生した。当該年度に生じた研究の遅延を取り戻すために、次年度には本研究費を用いて遺伝子合成の外部委託等も取り入れつつ、より効率的に研究を進めて行く予定である。
|
