内在性レトロウイルスHERV-Kのレトロトランスポゾン活性測定と阻止化合物の探索

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K07517
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 門出 和精 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (70516137)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: HERV-K / SOX2 / iPS cells / retrotransposon

研究実績の概要

ヒト内在性レトロウイルス（HERVs）は宿主との長い共存関係の中で本来の機能を消失し、化石化したと考えられてきた。しかし最近の研究では、HERVsは胚発生過程で重要な役割を担う一方で、近傍の宿主遺伝子の転写を制御することにより様々な疾患の発症や進行にも関与する可能性が注目されている。申請者の準備研究では、Sox2で活性化したHERV-KはiPS細胞のゲノムを転移することを見出した。そこで、本研究では、HERV-Kレトロトランスポゾンスクリーニングシステム構築とHERV-K関連疾患の治療薬探索（計画１）とHERV-Kゲノム転移の簡易的検出システムの構築（計画２）を実施する。本研究成果から、HERV-Kのゲノム転移が癌や神経疾患に影響する可能性について明らかにできる。さらに、iPS細胞の安定性維持やHERV-K関連疾患の治療薬開発に繋がることが期待される。
計画１：初年度、HERV-Kレトロトランスポゾン活性を定量するためのレポーターとして発光遺伝子にイントロンを挿入することで、レトロトランスポゾン活性を間接的に定量する方法を構築することに成功した。しかし、その活性は非常に低く、HERV-K遺伝子に改良を加えても改善することはできなかった。前年度には、shRNAライブラリーを使うことによって、HERV-Kレトロトランスポゾン活性を感度良く定量できる細胞株を樹立することに成功した。
計画２：初年度は、iPS細胞に新規HERV-Kインテグレーションサイトを次世代シークエンスで同定することができるようになった。前年度には、そのインテグレーションサイトを他の実験系で証明することを試みたが、新規HERV-Kインテグレーションサイトをもつ細胞数が非常に少ないこと、さらには細胞内に既に３００以上のHERV-Kが存在することから、検出方法に関しては難航している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

計画１：申請時の計画では、前年度に薬剤スクリーニングを開始する予定であったが、まだスクリーニングするには至っていない。その理由として、HERV-Kレトロトランスポゾン活性の証明が十分できておらず、この確認実験を行うことに約１年を費やしてしまった（論文revised実験）。もしも、このレトロトランスポゾン活性がartificialなものであった場合は、阻害剤をスクリーニングすることが無駄になることから慎重に再検討を行った。また、このレトロトランスポゾン活性は非常に低く、実験サンプル間でのバラツキが大きく、薬剤スクリーニングの数値の信頼性としても不十分であった。前年度の実験の結果、レトロトランスポゾン活性が間違いなく存在することが論文として認められた（J.Virol 2022)。さらに、shRNAライブラリーを使った制御因子探索の実験から、ある因子AをknockdownしたHeLa細胞株を使うことによって、非常に高いレトロトランスポゾン活性を再現よく定量することが可能となった。HIV-1の既存薬である逆転写酵素阻害剤（AZT）を処理した実験では、HIV-1に比べると効果が10倍程度低いが、逆転写阻害が確認できた。また、当初の計画にあるように蛍光標識したHERV-Kタンパク質を合成したため、現在、共焦点レーザー顕微鏡で、レトロトランスポゾン機構の詳しい解析を行っている段階である。
計画２：iPS細胞でのHERV-Kレトロトランスポゾンの解析については、他の実験系でも証明することができ、前年度に論文に投稿することができた（J.Virol 2022）。前年度は、量子生命科学研究所の先生と共同研究することとなり、多検体のiPS細胞を分与いただいたため、現在、予定通りに他のiPS細胞でのHERV-Kレトロトランスポゾン活性を検討している段階である。

今後の研究の推進方策

計画１：前年度に確立したスクリーニング系を使って、薬剤のスクリーニングを行う。最初の実験としては、逆転写酵素阻害剤のような既存薬をを検討する。前年度の実験で、AZTが効果は低いもののレトロトランスポゾンを阻害することが確認できたため、レトロウイルス既存薬にある程度の効果があることが期待される。既存薬から、候補薬剤が絞れた際には、その既存薬を合成展開し、さらに効果的な薬剤を開発する。合成展開に関しては、薬学部の立石助教と連携で遂行する。同時に、化合物ライブラリーのスクリーニングを遂行する。化合物ライブラリーは、薬学部の独自の化合物ライブラリーと天然化合物ライブラリーを提供いただき遂行し、候補化合物を探索する。
また、蛍光タンパク標識HERV-Kを用いることで、逆転写機構を詳しく解析する。さらにHERV-K変異体を用いることで、レトロトランスポゾン活性に関与するウイルスタンパク質がどのように関与するかについて詳しく検討を行う。
計画２：前年度に集めたiPS細胞に存在するHERV-Kインテグレーションサイトを次世代シークエンスで解析する。iPS細胞に新たなHERV-Kインテグレーションサイトが見つかった場合は、そのインテグレーションサイト近傍の遺伝子に及ぼす影響を検討する。また、他の共同研究者にも相談し、さらにiPS検体の収集を行う。

次年度使用額が生じた理由

コロナの流行拡大によって、国内外での学会参加が困難となり、旅費を使用する機会がなかったため。また、前年度の論文校閲費、投稿費は別の研究費から捻出することができたため、その分を今年度の論文投稿費に使用することにしたため。薬剤スクリーニングのために購入予定だった検出試薬は、今年度に購入することになったため。以上の理由から、当初予定していた使用額は次年度の研究に繰り越すことになりました。次年度は、学会参加費、論文投稿費に約70万、検出試薬に約100万かかるため、繰越金を全額使用する予定である。

研究成果

• [国際共同研究] University of Michigan(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of Michigan
• [雑誌論文] Movements of Ancient Human Endogenous Retroviruses Detected in SOX2-Expressing Cells (2022)
  • 著者名/発表者名: Kazuaki Monde, Yorifumi Satou, Mizuki Goto, Yoshikazu Uchiyama, Jumpei Ito, Taku Kaitsuka, Hiromi Terasawa, Nami Monde, Shinya Yamaga, Tomoya Matsusako, Fan-Yan Wei, Ituro Inoue, Kazuhito Tomizawa, Akira Ono, Takumi Era, Tomohiro Sawa, Yosuke Maeda
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: NA ページ: NA
  • DOI: 10.1128/jvi.00356-22
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Identification of host factors inhibiting the retrotransposition of human endogenous retroviruses (2022)
  • 著者名/発表者名: Kazuaki Monde
  • 学会等名: The 69th Annual Meeting of the Japanese Society for Virology
• [備考] iPS細胞における内在性レトロウイルスのゲノム転移を発見
  • URL: https://www.kumamoto-u.ac.jp/daigakujouhou/kouhou/pressrelease/2022-file/release220419-2.pdf
• [備考] ゲノムの中で今なお活動する、古代ウイルス
  • URL: https://c86ea3cb-263f-4684-8f1a-3b072ffa3c60.filesusr.com/ugd/b31ef2_ebec819ee2f0414bb50e47c6a80b44ba.pdf