2020 年度実施状況報告書

HIVとHBVの逆転写酵素の構造比較・解析を基盤とした新規抗HBV薬開発への応用

研究課題

研究課題/領域番号	20K07522
研究機関	国立研究開発法人国立国際医療研究センター
研究代表者	服部真一朗国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 上級研究員 (60709484)
研究分担者	安武義晃国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (20415756)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	HBV / HIV / 逆転写酵素 / 核酸アナログ
研究実績の概要	HBV感染症の治療に用いられる核酸アナログ製剤 (NA)は、長期投与による薬剤耐性変異の出現が問題であり、より強力な薬剤開発が必要である。HIVやHBVの逆転写酵素 (RT) はNAの標的ウイルスタンパク質であり、本研究ではHBV-RTのNAに対する感受性・薬剤耐性に関わるアミノ酸を同定、新規薬剤開発に資することを目的とする。 HIV-RTは結晶解析によりその構造は既に詳細に知られているが、HBV-RTは高い難容性のため結晶化成功例は皆無である。さらにHBVは限られた細胞にしか感染せず、感染実験が困難であった。我々はこれまでの研究でHIVとHBVのRTの機能部位の相同性が高いことを見出し、HIV-RTをHBV型のアミノ酸に置換したHBVキメラHIV-RTを作成することで、キメラタンパク質ではあるものの、世界で初めて抗HBV薬とRTの結晶化に成功した。さらにキメラRTを持つHIV (キメラHIV)を使うことで容易に感染実験を行うことが可能となった。本年度は、すでに結晶解析に成功している3MBキメラHIV逆転写酵素 (RT)(Q151M/F115Y/Y116F) をベースとし、さらなるアミノ酸置換の組み合わせと最適化を試行、新たにデザインした4Mキメラ（Q151M/F115Y/Y116F/L74V；野生型と同等の酵素活性を保持）を用いてNAとの複合体結晶データの取得を行った。また、テノホビルDPとの複合体結晶化が容易ではないことから、結晶化可能なDNAアプタマーの配列最適化を進めた。その他、薬剤耐性変異を導入した3MB/M184V/F160MとdNTP複合体の構造解析を行い、耐性変異により誘導される薬剤結合ポケットの微細構造変化を捉えることに成功した。今後はキメラHIVによる薬剤感受性試験、さらなる変異の試行を繰り返すことで、HBV-RTの重要アミノ酸の同定に寄与できると考える。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由当初の計画通り、3MBキメラHIV逆転写酵素 (RT) をベースとしたさらなるアミノ酸置換の組み合わせと最適化を試行し、新たにデザインした4Mキメラ（Q151M/F115Y/Y116F/L74V）を用いて、4位シアノ NAとの複合体結晶データの取得を行った。また、テノホビルDPとの複合体結晶化が容易ではないことから、結晶化可能なDNAアプタマーの配列最適化を進めた。その他、薬剤耐性変異を導入した3MB/M184V/F160MとdNTP複合体の構造解析を行い、耐性変異により誘導される薬剤結合ポケットの微細構造変化を捉えることに成功した（論文修正稿投稿中）。さらにこれらのキメラRT酵素活性を野生型HIV-RTと比較、野生型と同等の活性を確認した。一方、コロナ禍により、消耗品の一部に納品の遅延が頻発したため、薬剤感受性試験および結晶構造解析の一部に計画より遅延が生じた。
今後の研究の推進方策	今後の計画として、概ね予定通りの成果を得ているため、当初の計画通り、HBVキメラHIV-RTの作成を継続して実施、これまでの結果を基に最適化を図り、HBV-RTにより類似するRT取得を目指す。より良いHBVキメラHIV-RTが得られた場合は、既存薬に加えて、強力な抗HBV活性を有する新規開発化合物との共結晶構造解析を行う。また、酵素活性測定や薬剤感受性試験等を継続する。加えてこれまでに我々が確立した、抗ウイルス薬濃度を漸増させることで耐性変異を誘導する、HIVの薬剤耐性誘導試験を応用し、HBVキメラHIVの抗ウイルス薬に対する耐性誘導試験を実施、耐性獲得機序の解明を試みる。一方で、前年度計画に生じた一部遅延に関しては、次年度計画と併せて実施する。
次年度使用額が生じた理由	研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究は概ね計画通り実施され、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。しかしながら、コロナ禍の影響により、消耗品全般の納品に遅延が生じ、一部計画を予定通りに遂行できなかったため、次年度研究計画と併せて実施することとする。