| 研究課題/領域番号 |
20K07533
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構(名古屋医療センター臨床研究センター) |
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研究代表者 |
松岡 和弘 独立行政法人国立病院機構(名古屋医療センター臨床研究センター), その他部局等, 研究員(移行) (60617140)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | HIV-1 / Vif / APOBEC3 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト免疫不全ウイルス1型（以下:HIV-1）がコードするタンパク質であるVifは、ヒトの宿主防御因子APOBEC3（以下:A3）に結合し、A3の抗HIV-1作用を無効化する。これまでVifとA3の結合様式を理解するために、両者の結合に関与するアミノ酸および結合領域の構造学的な特徴をA3の単体構造から明らかにしてきた。一方で、その詳細を解明するために必要となる複合体構造は未決定のままである。そこで本研究では、Vif-A3H複合体の立体構造を決定し、構造情報に基づいて設計した変異体の機能解析を行うことで、原子・分子レベルでVif-A3H複合体の結合様式を解明することを目的とする。
当該年度において、Vif-A3H複合体の発現・精製法、大腸菌発現ベクターおよび結晶化条件の最適化を行い、X線回折測定できる大きさのVif-A3H複合体の単結晶の取得を目標に研究を実施し、以下の研究成果を得た。
１）Vif-A3H複合体に対して沈殿・凝集を抑制できる添加剤の探索を行った。その結果、特定の添加剤を精製時に加えることでVif-A3H複合体の沈殿・凝集が劇的に抑制され、結晶化に適する十分な質と量(十数mgオーダー)のVif-A3H複合体（5者複合体：Vif/CBF-b/ELOB/ELOC/A3H）を調整できることが可能な状況となった。
２）タンパク質工学を利用した大腸菌発現コンストラクトの最適化を進め、Vif-A3H複合体を形成することができるVifとCBF-bの最小領域を決定できた。
３）X線結晶構造解析によりVif-A3H複合体の立体構造を決定するために。結晶化条件（タンパク質の濃度、沈殿剤濃度、pH、温度、添加剤など）を検討した。しかし、現状では回折測定に適する十分な大きさに結晶を成長させることができなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
結晶化スクリーニングが行える十分な質と量のVif-A3H複合体（5者複合体：Vif/CBF-b/ELOB/ELOC/A3H）を取得するための発現・精製系に技術的な課題があった。本研究課題で、沈殿・凝集を抑制できる添加剤を見出すことに成功し、発現・精製系を確立することで、これまでの課題を解決することができた。この課題の克服により、発現コンストラクトと結晶化条件を検討することで回折測定に適する大きさの結晶を取得することが期待されたが、残念ながら単結晶は得られていない。一方で、Vif-A3H複合体の発現・精製法および大腸菌発現ベクターおよび結晶化条件の最適化などの今後の発展に繋がる十分な基礎的な基盤情報を取得することができた。新型コロナウイルスに関連する業務の影響などで多少の遅れは生じているものの、実験自体は概ね計画通りに行うことができたので、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
Vif-A3H複合体の立体構造の取得を最優先に研究を遂行する。Vif-A3H複合体を形成することができるVifとCBF-bの最小領域の決定など基盤情報を蓄積してきたが、発現コンストラクトや結晶化条件には改善の余地がある。引き続き結晶化条件や発現コンストラクトの最適化の条件検討を実施する。また近年、高分解能で解析が可能となってきたクライオ電子顕微鏡法によるVif-A3H複合体構造の解析も進めていく。最終的には、Vif-A3H複合体の立体構造を決定し、構造情報に基づいて設計した変異体の機能解析を行うことで、原子・分子レベルでVif-A3H複合体の結合様式の解明を目指す。次年度は、本研究で得られた基盤データに関して学会発表や学術論文として研究成果を積極的に発表していきたい。
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