| 研究課題/領域番号 |
20K07573
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
齋藤 敦 広島大学, 医系科学研究科(医), 准教授 (30580394)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 細胞老化 / OASIS / 癌 / 細胞周期 / メチル化 / エピゲノム編集 / p53 / p21 |
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| 研究実績の概要 |
小胞体膜貫通型転写因子OASISによる細胞周期制御機構の解析を実施した。OASISが抗癌剤処理などのDNA損傷に応答して膜内切断を受けることで転写因子として活性化し、細胞周期抑制因子p21の発現を直接誘導することを発見している。OASIS欠損マウスから採取した初代培養アストロサイトではDNA損傷依存的なp21の発現誘導が抑制されており、senescence-associated-beta-galactosidase染色によって検出される老化細胞が減少していることがわかった。p21の発現はp53によって誘導されることが知られている。両経路のクロストークを調べるために野生型およびOASIS欠損アストロサイトにおけるp53の活性化を検証したが、両細胞間でp53の活性化レベルに差は認められなかった。一方でp53をノックダウンしても、OASISはDNA損傷に応答して転写因子として活性化することも確認できた。さらにp53変異型癌細胞であるU251MG細胞にOASISを発現させるとp21を介した細胞老化が引き起こされることを見出した。このことから、OASISは単独でp53非依存的な細胞老化を誘導できることが明らかになった。U251MG細胞では内在性OASISの発現が極めて低いことからOASISプロモーターの高メチル化を疑い、bisulfite sequencing法でメチル化レベルを解析した。その結果、U251MG細胞のOASISプロモーターは高度にメチル化されていることがわかった。DNA切断活性をもたない変異Cas9（dCas9）、脱メチル化酵素TET1、OASISプロモーターを認識するガイドRNAをall-in-oneシステムで発現するコンストラクト（エピゲノムコンストラクト）をU251MG細胞に導入すると、内在性のOASISおよびp21の発現と細胞老化を誘導することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画であった小胞体膜貫通型転写因子OASISの機能解明に関して、OASISがp53活性非依存的にp21を介した細胞老化を誘導することを証明できた。また、癌細胞においてOASISプロモーター特異的に脱メチル化を引き起こすことができるエピゲノムコンストラクトを作成することに成功した。このコンストラクトを導入した癌細胞では内在性OASISの発現が回復するとともにp21を介した細胞老化が誘導され、細胞周期の停止と細胞増殖の抑制が観察された。以上の成果は当初の達成目標として掲げていたテーマであるため、計画はおおむね順調に進展していると判断する。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞老化は細胞周期の停止を介して癌化を抑制する生体内機構として受け入れられている。今後は免疫不全マウスを用いた異種間移植実験によってp53変異型の移植腫瘍にOASIS脱メチル化エピゲノムコンストラクトを外部から導入し、腫瘍の成長を抑制することを試みる。外部からのエピゲノムコンストラクトを導入する方法として、アデノ随伴ベクターやlipid nanoparticle法、アテロコラーゲン法の活用を検討している。上記複数の手法を検証・比較することで、高効率で腫瘍成長を抑制し、周辺の正常組織に影響を与えないコンストラクト導入法を確立する。以上の方策を通して、p53活性非依存的な新規癌治療戦略の基盤構築へと繋げる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
OASISプロモーターを特異的に脱メチル化するエピゲノムコンストラクトを作成するにあたって、当初は800bp以上にわたるOASISプロモーターのCpG island内で数十カ所の配列を認識するガイドRNAを作成し、高効率で脱メチル化が可能なガイドRNAを選別する予定であった。しかし7カ所の配列を認識するガイドRNAを作成した時点で、充分に脱メチル化と細胞老化を誘導できるガイドRNAを発見し、これを組み込んだエピゲノムコンストラクトの作成に成功した。これに係る予定であった費用は次年度において、エピゲノムコンストラクトを腫瘍組織に導入する実験に充てる予定である。即ち当初予定していたアデノ随伴ベクターの利用やlipid nanoparticle法に加えてアテロコラーゲン法なども検討し、最も高効率で腫瘍組織におけるOASISプロモーターの脱メチル化と細胞老化の誘導が可能な手法を確立する。
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