| 研究課題/領域番号 |
20K07591
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
鎌田 真司 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 教授 (20243214)
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| 研究分担者 |
岩崎 哲史 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 助教 (40379483)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 細胞老化 / LY6D / GPIアンカータンパク質 / 空胞形成 / マクロピノサイトーシス / Integrin β1 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、LY6Dが細胞外から細胞内へとシグナルを伝えるタンパク質を同定するため、タンデム質量分析法を用いてLY6Dと相互作用する膜タンパク質の網羅的な探索を行い、膜貫通型タンパク質であるIntegrin β1を含む5種類のタンパク質を同定した。Integrin β1について詳細な解析を行ったところ、Integrin β1の活性を阻害する中和抗体がLY6Dの発現に伴う空胞構造の形成を抑制し、さらに、RNA干渉法によるIntegrin β1の発現抑制によってLY6D誘導性のマクロピノサイトーシスが抑制されることが明らかとなった。また、Integrin β1のサイレンシングは細胞老化に伴い惹起されるマクロピノサイトーシスに対しても同様の抑制効果を示した。これらの結果から、LY6D誘導性マクロピノサイトーシスを惹起するシグナルはIntegrin β1を介在して細胞内に伝達されることが示された。Focal adhesion kinase (FAK) はIntegrin β1の下流因子であり、インテグリンシグナルの受容に伴い自己リン酸化を亢進してマクロピノサイトーシス制御因子として知られるSrc family kinase (SFK) の活性化を誘導する非受容体型チロシンキナーゼである。本実験では、LY6Dの発現に伴いFAKの自己リン酸化が亢進すること、また、FAK-SFK経路の遮断がLY6D誘導性マクロピノサイトーシスを抑制することが示された。以上の結果から、細胞老化関連タンパク質LY6DはIntegrin β1との相互作用を介してマクロピノサイトーシスシグナルを細胞内に伝達していること、またLY6DはFAK-SFK経路の活性化を介してマクロピノサイトーシスを惹起していることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、研究開始当初、次に示す実験を計画していた。(A) LY6Dが空胞形成を誘導するシグナル伝達経路の解明、として、(i) LY6Dの機能領域の解析、(ii) 細胞外から細胞内へとシグナルを伝えるタンパク質の同定、(iii) LY6Dの下流で働くRasの機能解析、(iv) Rasの下流で働きアクチンの重合を促進する分子の同定、(v) オートファジーとの関連について、である。また、(B) LY6Dが生体から老化細胞を除去するための標的分子となる可能性の検証、としては、(i) siRNA導入細胞を用いた解析、(ii) 抗LY6D抗体を用いた抗体依存性細胞傷害活性の検出、である。
以上の実験計画の中で、令和２年度中に成果が得られたものは、(A)(i)(iii)(v)であり、これらの実験結果は、原著論文（Nagano et al., J. Biol. Chem. 296, 1000049, 2021）として報告済みである。一方、令和２年度から令和３年度にかけて行った実験計画の一つが、(A)(ii)の細胞外から細胞内へとシグナルを伝えるタンパク質の同定である。Flagタグを付加したLY6Dを細胞に高発現させ、細胞老化誘導後に抗Flag抗体で免疫沈降後、共沈するタンパク質について質量分析による同定を行った。その結果、複数の膜貫通型受容体タンパク質を同定することに成功し、その中でIntegrin β1について詳細な解析を行ったところ、LY6Dによる空胞形成シグナルを細胞内へと伝達する機能を持つことが明らかとなった。その詳細は「研究実績の概要」で記載した通りである。本実験結果は原著論文として投稿済みであり、現在revise中となっている。以上より、本実験計画はおおむね順調に進展していると判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究としては、昨年度と同様、当初予定していた(A) LY6Dが空胞形成を誘導するシグナル伝達経路の解明、の中で、(i) LY6Dの機能領域の解析、を引き続き推進していく。LY6Dはアミノ酸配列の相同性からLY6ファミリーに属しており、Lu(LY6/uPAR)ドメインを介して他のタンパク質と結合することが予想されている。LY6ファミリーの中には、LY6Dと同様にLuドメインを持ちGPIアンカーによって細胞膜外葉に局在するLY6E、LY6H、PSCA(prostate stem cell antigen)が存在している。これら遺伝子をクローニングし、細胞内で高発現させることによって空胞形成誘導能を比較解析し、LY6D の空胞形成に重要なアミノ酸、及び機能領域を同定する。また、令和３年度に行った(ii) 細胞外から細胞内へとシグナルを伝えるタンパク質の同定、の中で、Integrin β1以外にも複数のLY6Dと相互作用する膜タンパク質の同定に成功しているため、これらのタンパク質についても解析を進め、細胞老化制御におけるLY6Dの機能を明らかにする。
次に、当初予定していた(B) LY6Dが生体から老化細胞を除去するための標的分子となる可能性の検証、の中で、(i) siRNA導入細胞を用いた解析、を行う。LY6Dをノックダウンした老化細胞とノックダウンしない老化細胞の混合培養系で、LY6Dをノックダウンした老化細胞だけが特異的に除去されるかどうか調べる。また、LY6Dに対するsiRNAとコントロールsiRNAをそれぞれ異なる蛍光色素で標識し細胞に導入後、血清アルブミンを添加した低栄養培地で培養した細胞に細胞老化を誘導し、LY6Dに対するsiRNAを導入した細胞のみが除去できることを確認する。
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