| 研究課題/領域番号 |
20K07626
|
|---|
| 研究機関 | 公益財団法人がん研究会 |
|---|
研究代表者 |
大橋 愛美 公益財団法人がん研究会, がん化学療法センター 分子薬理部, 主任研究助手 (50727427)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | サイクリン依存性キナーゼ / 分子標的薬 / 細胞死 / 細胞周期停止 / 低分子阻害薬 |
|---|
| 研究実績の概要 |
特定のがんに著効し正常細胞に殆ど影響を与えない治療標的を見出すため、39種類のヒトがん細胞株（JFCR39）のうち４種類の細胞株に選択的に細胞死を伴う強い抗がん作用を発揮し、他の細胞株には増殖抑制を起こすものの細胞死を誘導しない、海洋天然物ラメラリンNの合成誘導体Azalamellarin 4（Azalam4）に着目した。我々はこれまでに、本化合物がin vitroでサイクリン依存性キナーゼ（CDK）を広く阻害することを示しているが、その基本骨格がこれまでに開発されたCDK阻害剤やチロシンキナーゼ阻害剤とは大きく異なるため、ユニークな作用機序が期待されていた。 実際Azalam4は、PalbociclibなどのCDK4/6特異的阻害剤とは異なり、細胞選択的なアポトーシス誘導を示すことを昨年度までに明らかにしている。
そこで本年度は、本剤のJFCR39に対する細胞死誘導スペクトルに着目し、同様のスペクトルを有する抗がん物質のスクリーニングを広く進めた結果、RNA ポリメラーゼIIの活性調節に関わるRpb1のC末端ドメイン（CTD）のリン酸化を行うCDK9などのアイソフォームに強い阻害能を有するCDK阻害剤Dinaciclibと非常に高い相関を示すことを見出した。そこで、これらの薬剤処理後の遺伝子発現変動を比較した結果、Azalam4はDinaciclibと極めて類似した遺伝子発現変動パターンを示し、遺伝子オントロジー（GO）エンリッチメント解析でRNAポリメラーゼII依存的な転写活性調節に関わるGOタームが共通して上位に抽出されてくることがわかった。
以上の結果から、Azalam4はDinaciclib同様、RNAポリメラーゼII特異的な転写を調節することにより細胞選択的な細胞死を起こすものと示唆された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、Azalam4による細胞選択的な細胞死を起こす原因となる標的分子を明らかにすることを目的として、2つの解析手法を利用した。
第1に、JFCR39がん細胞株パネルに対する化合物の抗がん活性データベースを利用し、細胞増殖ではなく細胞死誘導のプロフィールを比較するために「Death Area(DA)」という新たな指標を開発した。DAとは、増殖阻害の用量応答曲線において増殖率０％の横軸と曲線の負の部分で囲まれた領域を指し、この値が大きいと細胞死が起きていると考えられる。Azalam4のDAプロファイルは、CDK4/6阻害剤とは大きく異なり、CDK9に強い阻害能を示すCDK阻害剤Dinaciclibと高い相関を示した。
第2に、これらのCDK阻害剤を、細胞死を起こすヒト肺がん細胞株へ処理し、6時間後の遺伝子発現変動プロファイルをRNA-sequence法を用い比較した。その結果、Azalam4は、Dinaciclibとよく類似した発現変動を示し、特に発現量が1/2以下に低下した遺伝子の80％以上が重複した。さらにGOエンリッチメント解析で、Azalam4はDinaciclibと同様に、RNAポリメラーゼII依存的な転写活性調節に関わるGOタームが上位に認められた。
以上の結果から、Azalam4は細胞選択的に細胞死を起こし、その標的はCDK阻害によるRNAポリメラーゼII依存的な転写調節を介していると示唆された。以上のように、本研究はおおむね順調に進んでいる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本研究は、Azalam4がどのような分子機序で「細胞特異的な細胞死」を誘導したのか、「細胞特異的な細胞死」に「特定のCDKアイソフォーム阻害活性」が関与するのかを明らかにすることを目的とする。
昨季までの研究で、JFCR39がん細胞パネルの特異的な細胞死、ならびにRNA発現変動のプロファイルがAzalam4と高い相関を示すCDK阻害剤を同定した。
本年度はこれらの化合物に共通する標的CDKアイソフォームの発現抑制試験を行い、アポトーシス誘導への各アイソフォームの関与を推定する。さらにJFCR39細胞株について取りためたオミックスデータ（遺伝子変異、遺伝子発現、蛋白質発現）を利用して、細胞死を起こす細胞株に共通して認められる遺伝的な特徴を見出す。また、見出した遺伝的な特徴と細胞死との因果関係を実験的に明らかする。また、薬剤添加による発現変動と組み合わされると合成致死を起こす分子を特定するため、細胞死ではなく細胞増殖停止を起こす細胞株を用い、Azalam4添加下shRNAライブラリースクリーニングを行い、合成致死の表現型を示す遺伝子を同定する。以上の研究により、RNAポリメラーゼII依存的転写調節により細胞死を起こす主たる要因のCDKアイソフォームと、合成致死を起こす分子の組み合わせを予測する。
また、Azalam4によるin vivo抗腫瘍効果と作用機構の概念実証を、今まで明らかにしてきた高感受性細胞株以外でも順次検証する。
|
