ドライバー変異が惹起する発癌経路に基づいた血中新規バイオマーカーの探索

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K07671
• 研究機関: 医療法人徳洲会札幌東徳洲会病院医学研究所
• 研究代表者: 小野 裕介 医療法人徳洲会札幌東徳洲会病院医学研究所, ゲノム診断研究部, 部門長 (40742648)
• 研究分担者: 水上 裕輔 旭川医科大学, 医学部, 教授 (30400089) ; 唐崎 秀則 医療法人徳洲会札幌東徳洲会病院医学研究所, がん生物研究部, 客員研究員 (50374806)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: がん早期発見 / リキッドバイオプシー / 遊離核酸 / バイオマーカー

研究実績の概要

1）これまでに血中cfDNAについてのデジタルPCR二次元マルチプレックス展開によるKRAS・GNAS遺伝子の膵癌におけるホットスポット変異（KRASコドン12、GNASコドン201変異）の同定解析系を構築していた。この系を改良し、微量の検体においても検出率を上げるための前増幅系についての条件検討（酵素、PCR条件）を行った。構築した前増幅系により膵癌EUS-FNA（超音波内視鏡下穿刺吸引法）検査に用いた生検針の洗い液より採取した微量組織からの高率な変異検出に成功した。得られた二次元マルチプレックスデジタルPCRの結果についての学術論文を投稿準備中である。２）血中遊離RNA（cfRNA）の変異解析、および発現プロファイリング解析を行う予備実験として、細胞培養上清より抽出した遊離RNAを疑似検体とした精製・検出プロトコールの検討を行った。約106個の細胞培養上清より抽出された遊離RNAは非常に微量であり、断片長も短く数10 bpにそのピークを認めた。膵癌由来細胞株の培養上清から得られた遊離RNAを用いて、デジタルPCRを用いたKRAS変異検出を行うための前増幅系を構築した。さらにバイオマーカーの検討として膵癌特異的に発現すると考えられる既知のlncRNAの検出を試みた。３）倫理承認済みの臨床研究「血液を使った低侵襲的な癌の診断に関わる研究」において登録された膵癌・IPMN症例の中から特徴的な症例について組織病理像とターゲットパネルシーケンスによる詳細な組織遺伝子プロファイルを評価した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

申請時において2020年度には、1) 改良した変異同定解析系による、cfDNAを用いた変異解析 2)遊離RNAの単離に関する予備実験。3)対象疾患についてのIPMN病理像再評価、の3点を進めることを計画していた。上記概要にて述べたようにそれぞれの点について実験・評価が進展しており、特に1)では微量検体を用いたデジタルPCR二次元マルチプレックスの前増幅プロトコールに関する学術論文を投稿準備中である。

今後の研究の推進方策

1）マルチプレックス解析系を用いた臨床検体については、微量生検については変異解析データの蓄積が進んでいるが、血中cfDNAの再解析と臨床データとの経時的分析については2021年度に重点的に進めて行く予定である。またマルチプレックス解析の前増幅プロトコール論文の採択を2021年度に目指す。2) 培養上清をモデルとしたcfRNAの精製に関しては解析に十分な収量を抽出できたとはいえず、またデジタルPCRを用いたRNA検出系についても特異度が極めて高い系を目指す必要があると考えられるため、条件検討を継続する。系が構築されたら血漿cfDNAからの検出を試みる。また、ゲノム編集により取得した膵癌細胞株におけるRNA-seqを実施し、その結果変動が大きな遺伝子について培養上清・血漿cfDNAでの検出と比較解析を進める。膵癌特異的なNon-codingのRNAバイオマーカー候補についてもcfRNAからの検出を引き続き検討する。

次年度使用額が生じた理由

2020年度に予定していた臨床検体を用いた解析が、まだあまり行われておらず、2021年度に重点的に行うことにしため、予算を繰り越した。

研究成果

• [雑誌論文] Prognostic significance of skeletal muscle decrease in unresectable pancreatic cancer: Survival analysis using the Weibull exponential distribution model (2021)
  • 著者名/発表者名: Sato Hiroki、Goto Takuma、Hayashi Akihiro、Kawabata Hidemasa、Okada Tetsuhiro、Takauji Shuhei、Sasajima Junpei、Enomoto Katsuro、Fujiya Mikihiro、Oyama Kyohei、Ono Yusuke、Sugitani Ayumu、Mizukami Yusuke、Okumura Toshikatsu
  • 雑誌名: Pancreatology 巻: 21 ページ: 892～902
  • DOI: 10.1016/j.pan.2021.03.002
  • 査読あり
• [雑誌論文] Serine/Threonine Kinase 11 Plays a Canonical Role in Malignant Progression of KRAS-mutant and GNAS-wild-type Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms of the Pancreas (2021)
  • 著者名/発表者名: Omori Yuko、Ono Yusuke、Morikawa Takanori、Motoi Fuyuhiko、Higuchi Ryota、Yamamoto Masakazu、Hayakawa Yuko、Karasaki Hidenori、Mizukami Yusuke、Unno Michiaki、Furukawa Toru
  • 雑誌名: Annals of Surgery 巻: Publish Ahead of Print ページ: -
  • DOI: 10.1097/sla.0000000000004842
  • 査読あり
• [雑誌論文] Monitoring epidermal growth factor receptor C797S mutation in Japanese non-small cell lung cancer patients with serial cell‐free DNA evaluation using digital droplet PCR (2021)
  • 著者名/発表者名: Ariyasu Ryo、Uchibori Ken、Sasaki Takaaki、Tsukahara Mika、Kiyotani Kazuma、Yoshida Ryohei、Ono Yusuke、Kitazono Satoru、Ninomiya Hironori、Ishikawa Yuichi、Mizukami Yusuke、Yanagitani Noriko、Fujita Naoya、Nishio Makoto、Katayama Ryohei
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: 112 ページ: 2371～2380
  • DOI: 10.1111/cas.14879
  • 査読あり
• [雑誌論文] The feasibility of circulating tumor DNA analysis as a marker of recurrence in triple-negative breast cancer (2021)
  • 著者名/発表者名: Okazaki Satoshi、Sasaki Takaaki、Yasuda Shunsuke、Abe Masahiro、Yoshida Nana、Yoshida Ryohei、Ishibashi Kei、Minami Yoshinori、Okumura Shunsuke、Chiba Shinichi、Takei Hidehiro、Hayashi Ryusuke、Nagato Toshihiro、Kobayashi Hiroya、Sugitani Ayumu、Ono Yusuke、Mizukami Yusuke、Kitada Masahiro、Ohsaki Yoshinobu
  • 雑誌名: Oncology Letters 巻: 21 ページ: -
  • DOI: 10.3892/ol.2021.12681
  • 査読あり
• [雑誌論文] Intracholecystic papillary neoplasm arising in the cystic duct and extending into common bile duct: a case report. (2021)
  • 著者名/発表者名: Masahiro I, Masamichi M, Yasutaka A, Shuichi A, Tatsuo H, Tatsuyuki T, Kei K, Kunihiro M, Masaharu I, Hideo O, Kei N, Hiroki H, Takanori M, Takashi K, Kiyoshi K, Atsushi K, Atsushi M, Yuko O, Yusuke O, Yusuke M, Toru F, Michiaki U.
  • 雑誌名: Clinical journal of gastroenterology 巻: 2 ページ: 668-677
  • DOI: 10.1007/s12328-020-01311-4
  • 査読あり
• [雑誌論文] Time-saving method for directly amplifying and capturing a minimal amount of pancreatic tumor-derived mutations from fine-needle aspirates using digital PCR (2020)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Ono, Akihiro Hayashi, Chiho Maeda, Mayumi Suzuki, Reona Wada, Hiroki Sato, Hidemasa Kawabata, Tetsuhiro Okada, Takuma Goto, Hidenori Karasaki, Yusuke Mizukami, Toshikatsu Okumura
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41598-020-69221-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Digital PCR-based plasma cell-free DNA mutation analysis for early-stage pancreatic tumor diagnosis and surveillance (2020)
  • 著者名/発表者名: Okada T, Mizukami Y, Ono Y, Sato H, Hayashi A, Kawabata H, Koizumi K, Masuda S, Teshima S, Takahashi K, Katanuma A, Omori Y, Iwano H, Yamada M, Yokochi T, Asahara S, Kawakubo K, Kuwatani M, Sakamoto N, Enomoto K, Goto T, Sasajima J, Fujiya M, Ueda J, Matsumoto S, Taniue K, Sugitani A, Karasaki H, Okumura T
  • 雑誌名: J Gastroenterol 巻: 55 ページ: 1183-1193
  • DOI: 10.1007/s00535-020-01724-5.
  • 査読あり
• [雑誌論文] How does intestinal-type intraductal papillary mucinous neoplasm emerge? CDX2 plays a critical role in the process of intestinal differentiation and progression. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yuko Omori, Yusuke Ono, Toshikazu Kobayashi, Fuyuhiko Motoi, Hidenori Karasaki, Yusuke Mizukami, Naohiko Makino, Yoshiyuki Ueno, Michiaki Unno, Toru Furukawa
  • 雑誌名: Virchows Archiv 巻: 477 ページ: 21-31
  • DOI: 10.1007/s00428-020-02806-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Resection for pancreatic cancer metastases contributes to survival (2020)
  • 著者名/発表者名: Hiroki Sato, Junpei Sasajima, Tetsuhiro Okada, Akihiro Hayashi, Hidemasa Kawabata, Takuma Goto, Kazuya Koizumi, Nobue Tamamura, Hiroki Tanabe, Mikihiro Fujiya, Shin-ichi Chiba, Mishie Tanino, Yusuke Ono, Yusuke Mizukami, Toshikatsu Okumura
  • 雑誌名: Medicine 巻: 99 ページ: e20564
  • DOI: 10.1097/md.0000000000020564
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genetic alteration of colorectal adenoma‐carcinoma sequence among gastric adenocarcinoma and dysplastic lesions in a patient with attenuated familial adenomatous polyposis (2020)
  • 著者名/発表者名: Hiroki Tanabe, Kentaro Moriichi, Keitaro Takahashi, Yusuke Ono, Yu Kobayashi, Yuki Murakami, Takuya Iwama, Takehito Kunogi, Takahiro Sasaki, Katsuyoshi Ando, Nobuhiro Ueno, Shin Kashima, Hidehiro Takei, Yusuke Mizukami, Mikihiro Fujiya, Toshikatsu Okumura
  • 雑誌名: Molecular Genetics & Genomic Medicine 巻: 8 ページ: e1348
  • DOI: 10.1002/mgg3.1348
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Serrated adenomas with a BRAF mutation in a young patient with familial adenomatous polyposis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kentaro Moriichi, Hiroki Tanabe, Yusuke Ono, Yu Kobayashi, Yuki Murakami, Takuya Iwama, Takehito Kunogi, Takahiro Sasaki, Keitaro Takahashi, Katsuyoshi Ando, Nobuhiro Ueno, Shin Kashima, Hidehiro Takei, Yusuke Mizukami, Mikihiro Fujiya, Toshikatsu Okumura
  • 雑誌名: International journal of colorectal disease 巻: 35 ページ: 1967-1972
  • DOI: 10.1007/s00384-020-03657-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] Metachronous intraductal papillary mucinous neoplasms disseminate via the pancreatic duct following resection. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kazumasa Nagai, Yusuke Mizukami, Yuko Omori, Toshifumi Kin, Kei Yane, Kuniyuki Takahashi, Yusuke Ono, Ayumu Sugitani, Hidenori Karasaki, Toshiya Shinohara, Toru Furukawa, Tsuyoshi Hayashi, Toshikatsu Okumura, Hiroyuki Maguchi, Akio Katanuma
  • 雑誌名: Modern pathology 巻: 33 ページ: 971-980
  • DOI: 10.1038/s41379-019-0405-7
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Intraductal papillary neoplasms of the bile duct consist of two distinct types specifically associated with clinicopathological features and molecular phenotypes. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yasutaka Aoki, Masamichi Mizuma, Tatsuo Hata, Takeshi Aoki, Yuko Omori, Yusuke Ono, Yusuke Mizukami, Michiaki Unno, Toru Furukawa
  • 雑誌名: The Journal of pathology 巻: 251 ページ: 38-48
  • DOI: 10.1002/path.5398
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic Tracing of Clonal Expansion and Progression of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma: A Case Report and Multi-Region Sequencing Analysis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Shion Tachibana, Yusuke Mizukami, Yusuke Ono, Yuya Sugiyama, Tetsuhiro Okada, Arisa Kitazaki, Junpei Sasajima, Motoya Tominaga, Jun Sakamoto, Keisuke Kimura, Yuko Omori, Toru Furukawa, Taichi Kimura, Shinya Tanaka, Kazuo Nagashima, Hidenori Karasaki, Tomoyuki Ohta, Toshikatsu Okumura
  • 雑誌名: Frontiers in oncology 巻: 10 ページ: -
  • DOI: 10.3389/fonc.2020.00728
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Multiplex digital PCR for detection KRAS and GNAS mutations.マルチプレックスデジタルPCR法を用いたKRASおよびGNAS遺伝子変異解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 前田知歩, 小野裕介, 水上裕輔
  • 学会等名: 第79回日本癌学会学術総会
• [備考] 医療法人徳洲会 札幌東徳洲会病院 医学研究所HP
  • URL: https://www.higashi-tokushukai.or.jp/inst_biomed_res/
• [産業財産権] 遺伝子解析用サンプルの製造方法 (2020)
  • 発明者名: 水上裕輔、小野裕介、林明宏
  • 権利者名: 水上裕輔、小野裕介、林明宏
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 徳願2020-217083号