| 研究課題/領域番号 |
20K07715
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
林 勇一郎 関西医科大学, 医学部, 博士研究員 (90378737)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 記憶 / 空間記憶 / 長期記憶 / カルシウムイメージング / 顕微鏡 / 前頭前野 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、前頭前皮質の情報表現の長期安定性について、実験動物としてマウスを用いカルシウムイメージングによる神経活動計測を用いて研究を行う。これを実現するため、大規模・高効率な神経活動イメージングを可能にする3次元イメージング法の開発、神経細胞の投射先を区別しながら同時イメージングを行うための2波長イメージング法の開発も同時に行う。
本年度は後者のイメージング手法開発を行った。本研究開始前に開発した3次元イメージング顕微鏡に対し、本体の軽量化、対物レンズの高NA化を行った。改良顕微鏡を用いて様々な条件で記録を行ったところ、Z方向の記録範囲は200-300マイクロメートル、記録細胞数は2次元イメージングの約2倍であった。
次に2波長イメージングの検討を行った。まず緑色カルシウムセンサーGCaMP6fに加え赤色カルシウムセンサーjRGECO1aをアデノ随伴ウイルスベクタによりマウス大脳皮質に発現させた。超小型蛍光顕微鏡であるUCLA miniscope v3を元に開発した2波長蛍光顕微鏡をマウスに装着しイメージングを行った。その結果、神経活動に伴うjRGECO1aの蛍光上昇が1細胞分解能で明確に記録出来た。しかしGCaMPに比べjRGECO1aの蛍光強度は低く、また励起用LEDは青色（GCaMP用）に比べ黄緑色（jRGECO1a用）は効率が悪いため十分な蛍光強度を得ようとするとLEDの温度上昇が激しくなり長期間の記録ができないことが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は研究に用いるイメージング手法の検討を行った。3次元イメージングに関しては2次元イメージングよりも高効率（約2倍の細胞数）で実験データの取得に使用できる見込みが立った。一方、2波長イメージングに関しては、イメージングは可能であるが実際の使用のためにはさらなる改良が必要である。以上の結果を踏まえ、次年度は技術開発と並行して実データの取得が行える。そのため概ね順調と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
3次元イメージングデータから神経活動を抽出する方法として、これまでPCA/ICAを用いてきたが、この方法は現在主流のCNMFEと比較して抽出できる細胞数およびSN比が劣る。しかしCNMFEは3次元データを処理できないという問題がある。そこで別の方法を検討する。
2色イメージングについてはLEDを用いた場合励起光量が不足している。これを解決するため、励起・蛍光フィルターの通過波長を最適化し効率を上げる、光源にレーザーを用い光ファイバーを介して励起光を供給するといった方法の検討を行う。また、2色イメージング装置は重量が過大（4g以上）でありマウスの行動に影響を与える恐れがある。これまでUCLA miniscope v3を元にイメージング装置を製作してきたが、より小型軽量であるv4ベースに切り替える。
これらの技術開発を行う一方、単色のカルシウムイメージング技術および行動実験については完成しているため、技術開発と並行して今年度からデータ取得を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍のため、出張をキャンセルしたことにより旅費使用が減少した。コンピュータソフトウェアについては無償のソフトウェアで代替できる見込みが立ったため購入を取りやめた。旅費使用については社会情勢を鑑みながら次年度以降の計画を立てる。ソフトウェア分の経費はコンピュータ購入に充てることでデータ処理能力を高める。
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