研究課題/領域番号 |
20K07735
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研究機関 | 名古屋大学 |
研究代表者 |
尾崎 智也 名古屋大学, 医学系研究科, 特任助教 (40710588)
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研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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キーワード | 神経軸索損傷 / コンドロイチン硫酸 / ドラッグリポジショニング / 脊髄損傷治療薬 |
研究実績の概要 |
本研究は、未だ有効な治療法のない脊髄損傷に対して、糖鎖結合分子が治療薬となり得るか評価するものである。中枢神経系の神経軸索は、傷つくと先端部にdystrophic endballと呼ばれる異常形態をとり、伸長不全に陥る。この損傷軸索に表れる表現型の原因分子は糖鎖コンドロイチン硫酸(CS)であることが知られている。これまでに申請者らは、dystrophic endballを損傷後の神経軸索が陥る病態であると考え、dystrophic endballについて詳細に解析を行い、その形成にはオートファジーの中断が関与することを見出した(Sakamoto*, Ozaki* et al., Nat. Chem. Biol. 2019 *equal contribution)。損傷した軸索についての理解が進む中で、CSの阻害効果を抑え、軸索の再生や再伸長を促すことに関する研究は多くなく、脊髄損傷など損傷軸索に対する治療法にむすび付いた研究はまだない。 本研究では、既存薬でありCS鎖に結合するペプチド(特許申請検討中のため、CSBPとする)を使い、CSPGの軸索伸長阻害効果を抑えることで、軸索再伸長を促し脊髄損傷を治療できるかどうかを吟味している。これまでに、dystrophic endballを培養できるin vitroモデルを使い、CSBPの効果を確認してきた。CSBPをdystrophic endballに処理すると、オートファジーの中断が解消され、軸索は伸長を再開させた。この結果をもとに、治療実験行い、これまでに、CSBPが、マウスにおいて脊髄損傷により著しく低下した後肢運動機能を改善させることを観察している。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マウスに脊髄損傷を負わせる機器が故障し、使えない状況が続いていた。これにより、in vivoの治療実験が進められなかった。特に、CSBP投与された脊髄損傷マウスにおいて、実際に神経軸索の再生/再伸長が起きているかどうかを評価する組織学的な解析が進めることができなかった。しかし、in vitro培養系での、CSBPによるdystrophicendball表現型の解消についての実験や、CSBPの投与タイミングをついて吟味することができ、よりCSBPの効果について情報を集めることができており、計画が遅れているとは考えていない。
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今後の研究の推進方策 |
今後は、組織学的な解析に取り掛かる。これまでに得られている脊髄を損傷したマウスの後肢運動機能のCSBP投与による改善が、運動神経の軸索再生に起因するものかどうかを検証する。脊髄損傷後、マウスにCSBP投与することで、脊髄組織内において実際に軸索の再生や再伸長が起こるかどうか検証していく。マウス脳にある運動野にビオチン化されたデキストランを注入する。デキストランは容易にアビジンを用いて検出できるため、こうすることで皮質脊髄路の神経線維を可視化できる。凍結切片を作成、脊髄の損傷部位付近の神経線維を可視化し観察、計測して、評価する。組織学的な軸索再生の解析は、組織透明化技術を駆使することも考えており、神経トレーサーを脳から注入し、標識した脊髄組織内の神経線維を透明化処理後に検出することに挑戦したい。困難な場合は、広く使われている、セロトニントランスポーター(SRET)でセロトニン神経線維、GAP43で再伸長過程の軸索を可視化し、CSBP投与が軸索再生/再伸長を促したか否か評価する。 また、CSBPが実際に損傷脊髄のCSPGが蓄積した部位に、届いているかは不明である。そこで、CSBPがマウス脊損部位に実際に届いているか確かめる。まずCSBPを、薬効を損なうことなく蛍光付加する。薬効は、in vitroでdystrophic endballを培養し、レスキュー実験を行い、評価する。薬効損失がないことを確認した上で、脊髄損傷し受傷後7日目のマウスに麻酔を施し、体温を維持しながら、2光子顕微鏡に設置する。尾静脈より蛍光標識CSBPを投与した後、損傷部位を観察する。標識CSBPのシグナルを観察できれば、CSBPが静脈投与で脊髄損傷部に届いたと言える。困難な時は、固定後に検出する。今後は、上記したように本研究計画を遂行していく。
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