2020 年度実施状況報告書

自閉症モデルマーモセットによる臍帯血移植治療法の開発

研究課題

研究課題/領域番号	20K07752
研究機関	国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター
研究代表者	一戸紀孝国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所微細構造研究部, 部長 (00250598)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	マーモセット / 自閉症 / 幹細胞
研究実績の概要	我々はこれまでに自閉症の原因の１つである抗てんかん薬のバルプロ酸と霊長類を用いて自閉症のモデルを作成し、行動学的、神経組織学的、分子生物学的、電気生理学的に解析し、自閉症の霊長類モデル動物としての地位を確立しつつある。この疾患の発症メカニズムは大変複雑で、これまでにこの疾患の根本的な病気の原因にアプローチした治療法はなかった。近年、幹細胞を用いた治療法があらゆる疾患で提唱されてきている中で、自閉症、発達障害においても幹細胞治療が根本的な治療法として実験動物のげっ歯類でまた人においても治験レベルで報告され始めている。げっ歯類では骨髄由来の間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell:MSCs）や脂肪由来の間葉系幹細胞の投与後、症状の改善が報告されている。また、人での治験レベルで臍帯血、臍帯血の間葉系幹細胞または骨髄の間葉系幹細胞の移植が行われ、自閉症症状の改善が報告され始めてきている。本研究はマーモセットの骨髄幹細胞及び臍帯血幹細胞を用いて霊長類であるマーモセットのバルプロ酸暴露自閉症の治療を試みるものである。本年度はまずは入手機会の多い骨髄にある幹細胞を分離培養し、純化、増殖を試みることることから始めた。生後０12316;６日令の新生マーモセットの５頭の大腿骨及び脛骨の骨髄より細胞を分離した。骨髄には血球系及びリンパ球系細胞の源となる造血幹細胞(Hematopoietic stem cells:HSCs)と脂肪・皮膚・軟骨・骨芽細胞の源となる間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell:MSCs）が存在する。接着性のあるMSCsと浮遊細胞であるHSCsはその接着性の差を利用して分離可能である。骨髄には多くの赤血球が含まれるので細胞を回収後、塩化アンモニウムを用いて赤血球を溶血し、培養に用いている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由大腿骨及び脛骨から分離された細胞はマーモセット１頭あたり5~6.6 x107個で、細胞生存率は92%以上を維持可能となった。培養を始めて早いもので２時間で細胞プレートの底に接着する細胞が見られる。接着性細胞であるMSCsはその特異的マーカーであるCD146, CD105, CD90, CD44, Stro-1 及びCD73が陽性で CD45, CD11b, CD14が陰性であることが報告されているので今後はこれらのマーカーを用いて免疫染色を行いFluorescence-activated cell sorting (FACS)解析を行う予定である。
今後の研究の推進方策	MSCsであることが確認されれば増殖可能な細胞であるので増殖後に凍結保存して移植に用いる。一方、浮遊細胞には自己複製能と血液系の細胞に分化する能力を併せ持つHSCsが含まれており、一般的にはCD34陽性細胞内に存在することが報告され、骨髄細胞内には１％以下の割合しか存在しないとされている。現在、マーモセットの細胞に対するCD34の抗体を用いて　Fluorescence-activated cell sorting (FACS)で解析中である。CD34陽性細胞が存在することがわかればMagnetic-Activated cell sorting(MACS)を用いて細胞分離、純化し、Stem cell factor(SCF), Thrombopoietin (TPO)を添加することによって増殖させる予定である。
次年度使用額が生じた理由	次年度も継続して研究を行う予定であるから