GPCRとアミロイドβ前駆タンパク質の巨大複合体形成による神経機能の制御

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K07765
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 上窪 裕二 順天堂大学, 医学部, 准教授 (80509670)
• 研究分担者: 高杉 展正 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (60436590)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: Gタンパク質共役型受容体 / アルツハイマー病 / 膜タンパク質 / GABA / 神経伝達 / 膜タンパク質

研究実績の概要

膜タンパク質を標的とした構造と機能解析技術の進歩に伴い、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)をはじめとする細胞膜タンパク質間の複合体形成と機能的な相互作用が明らかとなりつつある。膜タンパク質が形成する巨大な複合体は、膜タンパク質の本質であり、その実態を理解することは生命科学の発展に大きく寄与すると考えられる。本研究では多種類の膜タンパク質からなる巨大な複合体(超複合体)の形成とその機能を明らかにするため、アルツハイマー病(AD)の原因の1つであるアミロイドベータ(Aβ)の前駆タンパク質 (Amyloid precursor protein; APP)と神経伝達に関わるGPCR複合体が形成する複合体に注目する。
先行研究によってAPPの細胞外ドメインの一部が異種GPCR複合体を形成するB型ガンマアミノ酪酸(GABA)受容体(GABAB受容体)と相互作用することが報告された。代表者らはGABAB受容体をはじめとする神経伝達に関わるGPCRを発現する細胞株を作製し、APPおよび部分ペプチドとGPCRの相互作用について検討を行った。検討の結果、GABAB受容体をテトラサイクリン誘導性に発現する細胞株ではAPPとの相互作用は確認できなかった。そこで研究代表者らは、これらの相互作用を安定して評価するためにGABAB受容体を恒常的に発現する細胞株を作製した。さらに、ウイルスベクターによる遺伝子発現方法を改良し、細胞内カルシウムとcAMPをライブセル・イメージングにて評価できる測定系を確立した。申請者らはAPPと他のGPCRの複合体形成についてさらに解析を進め、蛍光ライブセル・イメージングによる評価を行った。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

昨年度に引き続き共同研究が実施し辛い状況が続き、研究に必要な消耗品などが世界的に不足する状況が続いたため研究の進捗が遅れている。一方で、申請者らは、ヒトGPCRのプラスミドライブラリーの作製やGタンパク質シグナル伝達の評価系の確立を進めてきた。そのため、当初の計画よりも研究範囲を広げて膜タンパク質の複合体形成の評価を行うことが可能となり、研究の推進が期待できる。

今後の研究の推進方策

HEK293細胞を用いた評価ではAPPとGABAB受容体の相互作用は確認できなかった。そのため、APPと他のGPCRの相互作用について解析を進める。複合体形成については、免疫共沈法と一分子イメージングを行い、機能的な相互作用については蛍光ライブセル・イメージングで細胞内シグナル伝達を評価する。細胞によって相互作用が異なる可能性が考えられるため、APPとGPCRの相互作用について培養神経細胞を用いて評価を行う。神経細胞内でのGPCRシグナルを評価するために、バキュロウイルスベクターによる遺伝子導入法の改良を目指す。APPと標的GPCRの相互作用が長期的な神経機能に影響を与える可能性を評価するため、脳スライス培養を用いた神経細胞の形態的、機能的な解析を実施する。

次年度使用額が生じた理由

共同研究が実施できない状況が続いたため消耗品などの使用量が当初予定より少なくなった。また、当初予定していた学会がオンライン発表となったり、中止になったりしたため、学会旅費などの使用がなかったため次年度使用が生じた。次年度の学会発表と共同研究のために使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Peripheral endomorphins drive mechanical alloknesis under the enzymatic control of CD26/DPPIV (2022)
  • 著者名/発表者名: Komiya Eriko, Tominaga Mitsutoshi, Hatano Ryo, Kamikubo Yuji, Toyama Sumika, Sakairi Hakushun, Honda Kotaro, Itoh Takumi, Kamata Yayoi, Tsurumachi Munehiro, Kishi Ryoma, Ohnuma Kei, Sakurai Takashi, Morimoto Chikao, Takamori Kenji
  • 雑誌名: Journal of Allergy and Clinical Immunology 巻: 149 ページ: 1085～1096
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2021.08.003
• [雑誌論文] Lipid flippase dysfunction as a therapeutic target for endosomal anomalies in Alzheimer’s disease (2022)
  • 著者名/発表者名: Kaneshiro Nanaka, Komai Masato, Imaoka Ryosuke, Ikeda Atsuya, Kamikubo Yuji, Saito Takashi, Saido Takaomi C, Tomita Taisuke, Hashimoto Tadafumi, Iwatsubo Takeshi, Sakurai Takashi, Uehara Takashi, Takasugi Nobumasa
  • 雑誌名: iScience 巻: 25 ページ: 103869～103869
  • DOI: 10.1016/j.isci.2022.103869
• [雑誌論文] Midbrain as an Ex Vivo Analysis Platform for Parkinson’s Disease (2021)
  • 著者名/発表者名: Kamikubo Yuji, Wakisaka Keiko, Imai Yuzuru, Sakurai Takashi
  • 雑誌名: Methods in Molecular Biology 巻: 2322 ページ: 111～117
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-1495-2_11
• [雑誌論文] Inhibition of endothelin A receptor by a novel, selective receptor antagonist enhances morphine-induced analgesia: Possible functional interaction of dimerized endothelin A and μ-opioid receptors (2021)
  • 著者名/発表者名: Kuroda Yui, Nonaka Miki, Kamikubo Yuji, Ogawa Haruo, Murayama Takashi, Kurebayashi Nagomi, Sakairi Hakushun, Miyano Kanako, Komatsu Akane, Dodo Tetsushi, Nakano-Ito Kyoko, Yamaguchi Keisuke, Sakurai Takashi, Iseki Masako, Hayashida Masakazu, Uezono Yasuhito
  • 雑誌名: Biomedicine & Pharmacotherapy 巻: 141 ページ: 111800～111800
  • DOI: 10.1016/j.biopha.2021.111800
• [雑誌論文] 異種G蛋白質共役型受容体相互作用による代謝型グルタミン酸受容体の制御 (2021)
  • 著者名/発表者名: 上窪 裕二, 田端 俊英, 坂入 伯駿, 櫻井 隆
  • 雑誌名: 脳神経内科 巻: 94 ページ: 468～475
• [学会発表] 1型代謝型グルタミン酸受容体とGABAB受容体における異種GPCR間複合体形成と双方向シグナル調節 (2022)
  • 著者名/発表者名: 坂入 伯駿, 上窪 裕二, 田端 俊英, 櫻井 隆
  • 学会等名: 第95回日本薬理学会年会
• [学会発表] 金属酸化物ナノ粒子の神経毒性 (2021)
  • 著者名/発表者名: 上窪 裕二, 櫻井 隆
  • 学会等名: 第44回日本神経科学大会 / CJK第1回国際会議
  • 国際学会
• [学会発表] AAV2/PHP.eBベクターを用いた海馬CA2野選択的標識 (2021)
  • 著者名/発表者名: 岡本 和樹, 上窪 裕二, 山内 健太, 岡本 慎一, 高橋 慧, 石田 葉子, 櫻井 隆, 小池 正人, 池谷 裕二, 日置 寛之
  • 学会等名: 第44回日本神経科学大会 / CJK第1回国際会議
  • 国際学会
• [学会発表] 低濃度鉛曝露による離乳後の仔ラットの注意力低下への 影響 (2021)
  • 著者名/発表者名: 大森 由紀, 上窪 裕二, 杉谷 善信, 松川 岳久, 小林 桃子, 武藤 剛, 横山 和仁, 角田 正史, 堀口 兵剛
  • 学会等名: メタルバイオサイエンス研究会
• [備考] 順天堂大学大学院 細胞・分子薬理学
  • URL: http://pharmacology.sakura.ne.jp/