AM-RAMP2系の骨格筋制御機構の解明と、サルコペニア・フレイルへの応用展開

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K07845
• 研究機関: 信州大学
• 研究代表者: 河手 久香 信州大学, 医学部, 研究員 (20507503)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: サルコペニア / フレイル / アドレノメデュリン / RAMP

研究実績の概要

未曾有の超高齢化社会が進行する中、高齢者の生活機能障害を予防し、自立性を維持することは喫緊の課題である。こうした背景の中、サルコペニア・フレイルの様な新しい疾患概念が提唱されたが、その分子病態については未だ不明点が多く、診断、治療法のコンセンサスは十分に得られていない。病態の発症過程に注目すると、サルコペニア・フレイルは、加齢に伴う生体内恒常性維持のための調節システムの異常が基本にあると考えられる。我々は、サルコペニア・フレイルの新規治療戦略のためには、生体内恒常性制御のメカニズムの包括的な解析を進め、病態の本質を解明することが不可欠であると考えた。
我々はこれまで生理活性ペプチド、アドレノメデュリン(AM)と、その受容体活性調節タンパクRAMPによる各臓器の恒常性維持機構に注目してきた。本研究では、各種の骨格筋特異的なAM-RAMP系の遺伝子改変マウスや、サルコペニアモデルマウスなどを応用して、AM-RAMP系の骨格筋の恒常性制御、特に骨格筋ミトコンドリア制御などにおける意義を解明する。さらに低分子化合物などを用いて、AM-RAMP系を人為的に操作することで、サルコペニア・フレイルの治療法開発に展開する。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

C57BL/6J野生型オスマウスを用い、筋傷害薬カルディオトキシン(CTX)を前脛骨筋に筋注する事で、骨格筋傷害モデルを作成した。CTX投与3日、AM、CLR、RAMP2、RAMP3の発現は著明に亢進し、AM-RAMP系の病態への関与が示唆された。RAMP2およびRAMP3ノックアウトマウス(RAMP2+/-, RAMP3-/-)に対してCTX投与を行なうと、コントロールマウスに比較して、有意な筋重量の低下を認め、筋組織内の炎症の消退遅延、骨格筋の再生遅延、ミトコンドリア機能の低下が認められた。一方、野生型マウスに対してAMを外因性に持続投与すると、骨格筋の炎症や酸化ストレスレベルが抑制され、ミトコンドリア生合成、エネルギー代謝系の亢進が認められた。
次に、マウスの後肢を、ガムテープとアルミホイルテープのギプスを使用して膝関節伸展位、足関節底屈位で14日間強制固定し、廃用性筋萎縮モデルを作成した。ギプス開放後の一過性浮腫が消退した2日目、筋重量、筋病理所見を観察したところ、RAMP2+/-、RAMP3-/-における筋重量の低下と、骨格筋細胞萎縮が確認された。
さらにマウス横紋筋由来筋芽細胞(C2C12)に対してCeramideを投与し、細胞老化誘導実験を行ったところ、AMの外因性添加によって細胞傷害が抑制されることが確認された。
以上の結果から、AM-RAMP2、3系は、骨格筋傷害に対して抑制的に働いていることが明らかとなった。AM-RAMP2、3系は、サルコペニアの予防、治療の新規治療標的となることが示唆される。

今後の研究の推進方策

サルコペニアの病態を評価するため、マウス後肢強制固定による廃用性筋萎縮モデルを確立する。マウスに対しギプス装着による２週間の強制後肢固定を行い、体重、前脛骨筋、下腿三頭筋、ヒラメ筋、大腿四頭筋の筋重量の変化、固定に伴う足底部浮腫の発生、握力の変化、歩行機能を、RAMP2ノックアウトマウス(RAMP2+/-)、RAMP3ノックアウトマウス(RAMP3-/-)、コントロールマウスとの間で比較検討する。
次に、骨格筋の病理組織所見、特に抗ラミニン抗体を用いた骨格筋細胞基底膜の免疫染色によって細胞間境界を描出し、骨格筋細胞断面積の分布を自動定量評価する。さらに骨格筋細胞のミトコンドリア機能を評価するため、コハク酸脱水素酵素（SDH: succinate dehydrogenase）染色を行い、染色度を定量評価する。
続いて、廃用性筋萎縮に伴う各種遺伝子の発現変化を、骨格筋組織のリアルタイムPCR法によって定量的に評価する。アドレノメデュリン(AM)、AMの受容体であるCLR、RAMPの発現変化を検討し、サルコペニアにおけるAM-RAMP系の意義を検討する。さらに、筋サテライト細胞の転写因子であるPax7、筋分化転写制御因子であるMyoDおよびMyogenin、骨格筋萎縮に関与するユビキチンリガーゼであるAtrogin-1およびMuRF1、ミオシン重鎖アイソフォームであるMHCIおよびMHCIIbなどの骨格筋関連因子の発現変化を検討し、骨格筋の質的変化を明らかとする。
RAMP2+/-およびRAMP3-/-における廃用性筋萎縮の亢進が見られた場合、RAMP2およびRAMP3による制御が示唆されている、ミトコンドリア機能、炎症、酸化ストレスレベルの変化などに注目し、サルコペニアの病態における両者の病態生理学的意義を明らかとする。

研究成果

• [雑誌論文] Adrenomedullin-RAMP2 system ameliorates pulmonary fibrosis by regulating TGF-β-Smads pathway and differentiation of myofibroblasts. (2021)
  • 著者名/発表者名: Wei Y, Tanaka M, Sakurai T, Kamiyoshi A, Ichikawa-Shindo Y, Kawate H, Cui N, Kakihara S, Zhao Y, Aruga K, Sanjo H, Shindo T.
  • 雑誌名: Endocrinology. 巻: 162 ページ: 1-22
  • DOI: 10.1210/endocr/bqab090
  • 査読あり
• [雑誌論文] Adrenomedullin-RAMP2 and -RAMP3 systems regulate cardiac homeostasis during cardiovascular stress. (2021)
  • 著者名/発表者名: Cui N, Sakurai T, Kamiyoshi A, Ichikawa-Shindo Y, Kawate H, Tanaka M, Tanaka M, Wei Y, Kakihara S, Zhao Y, Aruga K, Kawagishi H, Nakada T, Yamada M, Shindo T.
  • 雑誌名: Endocrinology, 巻: 162 ページ: 1-20
  • DOI: 10.1210/endocr/bqab001
  • 査読あり
• [雑誌論文] Adrenomedullin-RAMP2 system ameliorates subretinal fibrosis by suppressing epithelial-mesenchymal transition in age-related macular degeneration. (2021)
  • 著者名/発表者名: Tanaka M, Kakihara S, Hirabayashi K. Imai A, Toriyama Y, Iesato Y, Sakurai T, Kamiyoshi A, Ichikawa-Shindo Y, Kawate H, Tanaka M, Cui N, Wei Y, Zhao Y, Aruga K, Yamauchi A, Murata M, Shindo T.
  • 雑誌名: age-related macular degeneration. Am J Pathol. 巻: 191 ページ: 652-668
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2020.12.012.
  • 査読あり
• [学会発表] 肥満および脂肪肝におけるアドレノメデュリン2の病態生理学的意義 (2021)
  • 著者名/発表者名: 肥満および脂肪肝におけるアドレノメデュリン2の病態生理学的意義 神吉昭子、桜井敬之、新藤優佳、河手久香、田中愛、崔南奇、田中正明、Wei Yangxuan、柿原伸次、Zhao Yunlu、笠原智貴、有賀公亮、新藤隆行
  • 学会等名: 第94回日本内分泌学会
• [学会発表] サルコペニア病態におけるアドレノメデュリン-RAMP系の病態生理学的意義 (2021)
  • 著者名/発表者名: 有賀公亮、桜井敬之、神吉昭子、市川優佳、河手久香、田中愛、柿原伸次、Zhao Yunlu、松田順繁、新藤隆行
  • 学会等名: 第25回日本心血管内分泌代謝学会
• [学会発表] Elucidation of the Significance of the Adrenomedullin-RAMP System as a Novel Therapeutic Target for Sarcopenia (2021)
  • 著者名/発表者名: Aruga K, Sakurai T, Kamiyoshi A, Ichikawa-Shindo Y, Hisaka K, Tanaka M, Kakihara S, Zhao Y, Matsuda Y, Kasahara T, Shindo T.
  • 学会等名: 第86回日本循環器学会
• [備考] 信州大学医学部 循環病態学教室
  • URL: http://www7a.biglobe.ne.jp/~shindo/