バイオ3Dプリンターを用いた脳アミロイド血管症モデルの病態機序の解明

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K07890
• 研究機関: 佐賀大学
• 研究代表者: 原 英夫 佐賀大学, 医学部, 教授 (00260381)
• 研究分担者: 中山 功一 佐賀大学, 医学部, 教授 (50420609)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: アルツハイマー型認知症 / 脳アミロイド血管症 / バイオ3Dプリンター / アミロイドβ蛋白

研究実績の概要

アルツハイマー病(AD)に伴い高頻度で脳アミロイド血管症（CAA）が併発する。老人斑の主成分であるAβ40蛋白は主に脳血管の平滑筋に沈着し、脳出血、脳梗塞、血管炎などを惹起するCAAの原因となる。CAAの病態は、ADの病態と重複している点がある。CAA周囲に起こる炎症状態も認知機能低下に関与している。我々はバイオ3Dプリンターを用いて、ヒト由来の細胞から成る血管構造体を作成し、血液脳関門の構造・機能を持ったモデルを作成している。ヒト線維芽細胞((NHDFs)、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)、ヒト初代培養アストロサイト(HAs;)、ヒト脳血管ペリサイト細胞(HBVPs)は細胞培養用ディッシュで培養した。バイオ3Dプリンターを用いて、スフェロイドを9x9本の針が並べられた微小なニードルを配置した剣山上に積層した。チューブ型に形成して還流培養を行い、１週間後に構造体を剣山から外し、蛍光ラベルAβ40を0.５μMの濃度で培地に添加し、還流培養を継続した。蛍光免疫染色では、Aβ40は、大動脈平滑筋細胞内部やその周囲に多く見られた。大動脈平滑筋細胞、大動脈内皮細胞の構造は保たれていた。生体では、Aβ40の沈着した血管は組織が脆弱になっており、脳出血の原因となっている。血管状構造体でも同様の結果が得られるか検証した。で用いた血管状構造体を、張力計 (Tissue Puller 560TP, DMT)を用いて引張試験を行った。引張強度はAβ投与群と未投与群で明らかな差は見られなかった。しかし、グラフの傾きはAβ投与群で大きく、Aβ投与群は組織が硬化していると考えられ、Aβ投与により組織が硬化して弾力が失われた可能性があると考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

今年度の実験によりヒト線維芽細胞((NHDFs)、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)、ヒト初代培養アストロサイト(HAs;)、ヒト脳血管ペリサイト細胞(HBVPs)の4種類の細胞を混合したスフェロイドを積層し、血液脳関門を持つ血管構造体の作成を行い血管構造体の内腔面をHUVECsが覆っていることを確認し、構造的には血液脳関門に近似した血管構造体が作成することができた。この血管状構造体にAβ40を投与すると、平滑筋細胞内部や周辺の組織に沈着することが確認できた。これによりアミロイド血管症の状態に近いモデルを作成することが出来た。また、Aβ40が沈着した血管状構造体は、組織が硬化し弾力が失われた。これは、生体での脳血管脆弱を再現している可能性があると考えられた。

今後の研究の推進方策

4種類（NHDFs/Huvecs-RFP/Pericytes/Astrocytes）の細胞を混合した血液脳関門を持つ血管構造体の透過性を検証するために3種類の試薬FITC-IgG、FITC-dextran (MW70kDa)、Evans Blue (MW 960.81)を用いて実験を行う。さらに血管構造体の内腔から外腔へEvans Blueが透過するかどうか実験を行う予定である。さらにAβ40、Aβ42の血管透過性をApoE蛋白（の有無と種類）を用いて検証する予定である。Aβ40が沈着した血管状構造体は血管壁の脆弱性が強くなっているので、血管構成蛋白に変化が起こっているか、マイクロアレイを用いたmRNA発現解析を行う。一方スタチンやシロスタゾール等の薬剤を投与することで、血管構造体の脆弱性を改善できるか検討を行う。

研究成果

• [雑誌論文] 認知症 (2021)
  • 著者名/発表者名: 原英夫
  • 雑誌名: 臨床と研究 巻: 98 ページ: 62-67
• [雑誌論文] Genome-wide association study of HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis in the Japanese population. (2021)
  • 著者名/発表者名: M Penova S Kawaguchi,J-i Yasunaga,T Kawaguchi,T Sato, M Takahashi, M Shimizu, M Saito, K Tsukasaki, M Nakagawa, N Takenouchi, H Hara, E Matsuura, S Nozuma, H Takashima, S Izumo,T Watanabe, K Uchimaru, M Iwanaga, A Utsunomiya, Y Tabara, R Paul,Y Yamano, M Matsuoka, F Matsuda.
  • 雑誌名: PNAS 巻: 118 ページ: e2004199118
  • DOI: 10.1073/pnas.2004199118
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Meta-iodobenzylguanidine myocardial scintigraphy in Perry disease. (2021)
  • 著者名/発表者名: Mishima T, Fujioka S, Nishioka K, Li Y, ato K, Houzen H, IYabe I, Shiomi K, Makoto Eriguchi M, Hara H, Hattori N, Tsuboi Y
  • 雑誌名: Parkinsonism and Related Disorders 巻: 83 ページ: 49-53
  • DOI: 10.1016/j.parkreldis.2020.12.017
  • 査読あり
• [雑誌論文] Olfactory-cognitive index distinguishes involvement of frontal-lobe shrinkage as in sarcopenia from shrinkage of medial temporal areas and global brain as in Kihon-Checklist frailty/dependencein older subjects with progression of normal cognition to Alzheimer's disease. (2021)
  • 著者名/発表者名: Iritani 0,Okuno T, Miwa T, Makizako H, Okutani F, Kashibayashi T, Kumiko S, Hara H, Mori E, Omoto S, Suzuki H, Shibata M, Adachi H, Kondo K, Umeda-Kameyama Y, Kodera K, Morimoto S
  • 雑誌名: Geriatrics & Gerontology International 巻: 21 ページ: 291-298
  • DOI: 10.1111/ggi.14128
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of imaging-based risk scores for prediction of intracranial haemorrhage and ischaemic stroke in patients taking antithrombotic therapy after ischaemic stroke or transient ischaemic attack: a pooled analysis of individual patient data from cohort studies. (2021)
  • 著者名/発表者名: Best JG, Ambler G, Wilson D, Lee K-L, et al.（97番目）
  • 雑誌名: Lancet Neurol. 巻: 20 ページ: 294-303
  • DOI: 10.1016/S1474-4422(21)00024-7
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Clinicopathological features of oculopharyngo distal myopathy with LRP12 CGG repeat expansions; Compared with other oculopharyngodistal myopathy subtypes. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kumutpongpanich T, Ogasawara M, Ozaki A, et al.（36番目）
  • 雑誌名: JAMA Neurology 巻: 78 ページ: 853-863
  • DOI: 10.1001/jamaneurol.2021.1509
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Intracranial Monckeberg's atherosclerosis is frequently found in autopsy cases of advanced stage malignancy with cerebral infarction (2021)
  • 著者名/発表者名: C Shichijo, K Kai, K Jinnouchi, M Nishihara, H Hara, S Aishima.
  • 雑誌名: Cancers 巻: 13 ページ: 5234-5244
  • DOI: 10.3390/cancers13205234
  • 査読あり
• [雑誌論文] 特発性好酸球増加症候群による非心原性多発穿通枝梗塞の1例 (2021)
  • 著者名/発表者名: 飯田紘太郎、薬師寺祐介、井手俊宏、鶴岡ななえ、七條千佳、原英夫
  • 雑誌名: 臨床神経 巻: 61 ページ: 319-324
  • DOI: 10.5692/clinicalneurol.cn-001561
  • 査読あり
• [学会発表] アルツハイマー型認知症の病態修飾薬の展望 (2022)
  • 著者名/発表者名: 原英夫
  • 学会等名: 第72回日本内科学会九州支部生涯教育講演会
  • 招待講演
• [学会発表] 第40回日本認知症学会学術集会 専門医試験対策講座 アルツハイマー病と症候学 (2021)
  • 著者名/発表者名: 原英夫
  • 学会等名: 第40回日本認知症学会学術集会