| 研究課題/領域番号 |
20K07926
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
小藤 剛史 杏林大学, 医学部, 助教 (40365200)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | シンタキシン１ / グリア細胞 / 神経伝達物質 / 抑制性シナプス |
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| 研究実績の概要 |
シンタキシン1(STX1)は神経細胞に豊富に発現しており、神経伝達物質の分泌やそれらの輸送体の活性制御に関わっている。我々が作製したSTX1遺伝子欠損マウスはヒトの精神神経疾患を模擬できる様々な行動異常を示すが、これには神経細胞でのSTX1欠損によるシナプス伝達機能の異常が大きく関与している。一方、STX1がグリア細胞にも発現していることから、マウスの行動異常にはグリア細胞でのSTX1欠損が関与している可能性がある。これまでに、STX1欠損グリア細胞において神経伝達物質であるGABAやグリシンの取込異常があることがわかってきた。しかし、グリア細胞のSTX1が神経細胞のシナプス形成やシナプス伝達機能にどのように関わっているかは十分に検討されていない。
グリア細胞のSTX1が神経細胞の形態やシナプス形成に関与しているかを検討するために、各遺伝子型グリア細胞(野生型(WT)およびSTX1A欠損、STX1B欠損)上でWT海馬神経細胞を培養した。培養７、１４日目では主要な神経突起数や分岐数、プレシナプスマーカーであるシナプトフィジンの斑文数においてSTX1欠損による影響は認められなかった。また、同条件下でWT海馬神経細胞に対する電気生理学的解析で抑制性シナプス伝達機能について検討したところ、mIPSCの振幅、頻度ともに差は認められなかった。しかし、より長期間培養した２０日目以降では、WTグリア細胞上で培養したWT神経細胞の方が、STX1B欠損グリア細胞上で培養したWT神経細胞よりもmIPSCの頻度が高いことがわかった。そこで、長期培養した神経細胞の形態やシナプス形成に関して検討したが、差は認められていない。また、in vivoでの行動解析のため、それに対応した強制発現系や発現抑制系の準備も行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、昨年度前倒して行った電気生理学的解析を継続して行った。当初予定の培養１４日目前後での解析では、各遺伝子型グリア細胞による抑制性シナプス伝達機能への影響は認められなかった。しかし、より長期の培養によって差が出てくることが明らかになった。そのため、長期培養条件下での神経細胞の形態やシナプス形成に関しての検討を進めたが、顕著な差は認められなかった。そこで、ポストシナプスマーカーでの確認を行うとともに、切片レベルでの解析を検討している。さらに、STX1B欠損(ヘテロおよびヌル)神経細胞を用いて形態やシナプス形成の検討および電気生理学的解析も行っている。また、in vivoでの検討のために、これに対応した強制発現系を構築し、有効性の検討を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度以降の研究計画として、長期培養条件下においてSTX1欠損による神経細胞の形態やシナプス形成への影響について、引き続き検討する。また、電気生理学的解析に関しては、さらに例数を増やして検討するとともに、興奮性シナプス伝達機能への影響に関して解析する。以上の検討において影響が確認されたものに関しては、当初の予定通りGABA再取込の阻害やSTX1強制発現等による効果も検討する。また、in vivo用に構築した強制発現系を用いて、STX1欠損マウスで見られる熱性けいれん、けいれん感受性増強等へのグリア細胞のSTX1の効果を検討する予定である。また、発現抑制系の準備も進めていきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は計画していた実験がおおむね順調に進んだが、当初計画より長期での培養条件下での実験が主流となった。そのため、より円滑な検討を進めるにあたり、マウス数の確保や培養数を増やすための実験器具や試薬等の費用にあてた。また、in vivoでの強制発現系を構築し、有効性の検討を行う費用も生じた。以上の使用額では昨年度からの繰り越し分も含めた額を消化するまでには至らず、次年度に使用する費用が生じた。
次年度以降は、有効性を確認したin vivoでの強制発現系を十分に確保するための費用にあてるとともに、この系を用いて、熱性けいれんやけいれん感受性等への検討を行うために使用する。また、継続して行う電気生理学的解析および組織化学的、生化学的解析のために必要な実験器具や試薬購入にあてる。併せて、in vivo用の発現抑制系の準備のためにも使用する予定である。in vivo実験の結果によっては、グリア細胞あるいは神経細胞特異的コンディショナルSTX1欠損マウスを交配で得るために、遺伝子変異マウスの購入を検討したい。
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