| 研究課題/領域番号 |
20K08100
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
榎本 敦 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (20323602)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | カルシウム / 放射線 / 温熱 / MAPK / MAP3K / TAK1 / MEKK2 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、細胞致死あるいは放射線増感に直結する原因タンパク質を生化学的アプローチにより同定し、放射線あるいは他の療法との併用による抗腫瘍効果における真の標的を明らかにするとともに創薬に向けた土台を構築することを目的とする。正常細胞と様々な癌組織由来の培養細胞を用いて、エックス線、紫外線、抗がん剤や温熱などの単独あるいは併用時によるタンパク質の挙動について二次元電気泳動および質量分析装置を使用したプロテオーム解析を実施した。その結果、温熱処理特異的に発現量が低下する因子としてMAPKキナーゼカスケードを構成し、MAP3KメンバーであるMEKK2、RAF1、TAK1を同定した。面白いことにエックス線照射ではこれらのMAP3Kメンバーの発現低下は認められず、また温熱処理時に他のMAPKカスケード構成因子MAP2KであるMEK5、MKK4やMAPKに属するJNK、ERK1/2などにも発現変化は認められなかった。これら温熱特異的なMAP3Kの発現低下のうち、MEKK2とTAK1についてはパク質分解酵素の阻害剤であるALLNやCalpeptinなどによって抑制されたことから、遺伝子発現レベルによる調節ではなく、タンパク質分解経路による翻訳後修飾によるものであることが判明した。一方、RAF1に関しては、RT-PCR解析により遺伝子発現レベルでの低下とあることが推測された。温熱処理によるMEKK2TAK1の発現低下がカルパイン阻害剤で抑制されることから、カルシウムイオノフォアA23187による影響を解析した結果、やはりMEKK2、TAK1の分解が見られ、それらの分解はカルパイン阻害剤で抑制された。これらのことから温熱特異的なMAP3Kの発現低下はカルシウム経路によるタンパク質分解系が関与していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
これまでに様々な細胞株を用いて温熱処理時にMEKK2、TAK1,RAF1などMAP3Kに属するタンパク質分解が起こることを見出した。これらの発現低下はカルパイン阻害剤により抑制されたことから、カルパイン経路の活性化によるものであることが推察された。一方、カルパインの活性化にはカルシウム濃度の上昇が必要であり、細胞内カルシウム濃度の上昇によるMAP3Kへの影響を調べた結果、カルシウムイオノフォアA23187はMEKK2やTAK1を限定分解することを見出した。さらにカルシウムインジケーターを用いた細胞局在解析においても温熱が劇的に細胞内カルシウム濃度を高めることを確認できた。このように培養培養細胞を用いた温熱処理によるタンパク質解析の結果が再現性良く見られ、阻害剤実験による分解系の関与を速やかに判断できた。また基質タンパク質の精製もキットを使用することにより大量かつ短時間で行うことが出来、研究全般的に順調に遂行している。但し、コロナ禍ということもあり、学会発表の機会に恵まれず、活発な意見交換が難しい状況でった。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに細胞を温熱した際にMAP3Kに属するMEKK2、RAF1やTAK1などのタンパク質発現量が低下すること、そのうちMEKK2やTAK1の発現低下がカルパイン阻害剤で抑制されること、タンパク質分解に先立って温熱処理後速やかに細胞内のカルシウム濃度が亢進することがわかった。次に温熱によるMAP3Kのタンパク質分解メカニズムを明らかにするため、これらのMAP3Kタンパク質がカルパインの基質となるかin vitro cleavage assayにおいて検証する。またなぜMAPKシグナリングカスケードのうちMAP3Kのみ温熱感受性であり、MAP2KやMAPKが非感受性であるのかバイオインフォマティクスを用いた配列解析や相互作用因子の予測により検討を行う。さらに温熱によるMAP3K発現低下の生物学意義を解析するため、siRNAを用いた遺伝子干渉によりそれぞれの遺伝子発現を人為的に低下させた細胞の挙動を検証する。具体的には細胞増殖・細胞周期についてフローサイトメーターによる解析を進める。一方で、温熱によるタンパク質の分解系の活性化は一過的なものと考えられている。カルシウムインジケーターあるいはGFPで標識したMAP3Kを用いて、温熱処理後のMAP3Kタンパク質の定常レベルまでの回帰と細胞再増殖との相関を調べることにより、放射線増感の誘導に効率的な行うタイミングを検討する。またコロナ禍により学会開催が不透明なところもあるため、関連学会にも積極的に参加して議論を深める機会を多くする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定されていた実験が順調に進み、試薬代を節約できたことやコロナ禍において学会出張がなくなったため旅費を使用しなかったため。
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