| 研究課題/領域番号 |
20K08158
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
津村 弥来 広島大学, 医系科学研究科(医), 研究員 (80646274)
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| 研究分担者 |
岡田 賢 広島大学, 医系科学研究科(医), 教授 (80457241)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 複合免疫不全症 / 原発性免疫不全症 / ユビキチン修飾 |
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| 研究実績の概要 |
CYLDは脱ユビキチン化酵素であり、NF-kBシグナル伝達を負に制御し、細胞増殖能、免疫能等を調節すると考えられている。我々はCYLDに複合ヘテロ変異を持つ患者を同定している。昨年度は、患者の免疫系細胞が数的および機能的異常を示すこと、並びに一過性強制発現系による機能解析で、CYLDの各変異体がTNF-α誘導性のNF-κBシグナル伝達を増強させることを明らかにしている。
本年度は、以下の3項目について検証した。①患者由来末梢血を用いたNF-κBの活性化レベルの検討：NF-κBのcomponentであるp65のリン酸化レベルをフローサイトメトリーを用いて精査した。CD19+B細胞へのCD40L+IL-4刺激およびCD14+単球へのLPS刺激では、健常者と同程度のNF-κBの活性化を示した。一方、CD3+T細胞におけるPMA+Ionomycin刺激では、健常者と比べて若干低下する傾向がみられた。②in vitroでの脱ユビキチン化能の検討：CYLD は、K63およびMet1 結合型のユビキチン鎖を特異的に切断する。293細胞への一過性強制発現系を用いてCYLD変異バリアントの脱ユビキチン化能について検討した。CYLD野生型では、両ユビキチン鎖を効率的に脱ユビキチン化したのに対し、両変異体ともに脱ユビキチン化の障害をみとめた。③患者由来骨髄を用いた破骨細胞形成の機能評価：患者は骨粗鬆症を発症している。骨髄細胞を用いて、破骨細胞へ分化誘導を行い、CYLDバリアントの破骨細胞形成に対する機能的意義を検討した。健常者と比較して、患者の破骨細胞は過形成をみとめ、骨吸収能も亢進することが明らかとなった。また患者の破骨細胞では、破骨細胞の主要転写因子であるNFATc1の発現が上昇していた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CYLDは脱ユビキチン化酵素であり、NF-κBのシグナル伝達を負に制御することが知られている。そのため今年度行なった患者末梢血由来の免疫系細胞に各種刺激に対するNF-κBの活性化は、健常者と同程度ないしは低下していた。昨年度行なった一過性強制発現系の実験からは、CYLDの各変異アレルは、TNF-αによるNF-κB活性化に対する阻害活性を減弱させる結果を得ており、想定外の結果である。条件設定の問題なのか、患者の病態を反映した結果なのか、議論の余地があるが非常に興味深い結果を得ることができた。一過性強制発現系の実験から、患者で同定されたCYLDの両変異アレルとも、Met1-及びK63結合型ユビキチン鎖に対する特異的脱ユビキチン化能が障害される結果が得られた。また、破骨細胞形成を検討する実験では、患者由来の破骨細胞が過形成を示すことが明らかになった。患者は骨粗鬆症を呈しており、病態を反映する結果が得られたといえる。したがって現在のところ、当初の計画通りにおおむね順調に研究が進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に続き、次年度も患者末梢血を用いて、NF-κBシグナル伝達への影響を検討する。本年度の再検に取り組むとともに、さらにT, Bリンパ球のシグナル伝達への影響を重点的に精査する予定である。また、脱ユビキチン化アッセイについてもさらに取り組む予定である。一過性強制発現系を用いたNF-κBシグナル伝達を担う分子に対する脱ユビキチン化能の検討、及び患者由来の線維芽細胞を用いた脱ユビキチン化能の検討を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
健常者由来および患者由来の線維芽細胞を用いて網羅的RNA発現解析を行う計画を立てている。本年度は、刺激の条件設定を行なったため、解析することができなかった。そのため、解析費用を次年度に持ち越すことにした。
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