ユビキチン修飾異常による複合免疫不全症の病態解明

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K08158
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 津村 弥来 広島大学, 医系科学研究科(医), 研究員 (80646274)
• 研究分担者: 岡田 賢 広島大学, 医系科学研究科(医), 教授 (80457241)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 複合免疫不全症 / 原発性免疫不全症 / ユビキチン修飾

研究実績の概要

脱ユビキチン化酵素であるCYLDは、NF-κBシグナル伝達を負に制御し、細胞増殖や免疫恒常性に関与する。家族性円柱症の家系例において、CYLDに複合ヘテロ変異を同定し、CYLDのmRNAおよびタンパク発現が著減することを明らかにしている。本研究の成果として、患者の免疫系細胞が数的および質的な異常を示すこと、一過性強制発現系による機能解析からCYLDの各アレルがTNF-α 誘導性のNF-κBシグナル伝達を増強させることを明らかにしている。CYLDの両アレルとも、Met1-及びK63結合型ユビキチン鎖に対する特異的脱ユビキチン化能が障害されることも明らかにしている。さらに、患者では破骨細胞の過形成が示され、患者でみとめる骨粗鬆症の病態を反映する結果も得ている。
本年度は、以下の2項目について検討した。①線維芽細胞を用いた脱ユビキチン化能の検討：M1およびK63結合のユビキチン鎖の蓄積を測定することにより評価した。患者では、TNF-α刺激によるM1結合のユビキチン化は軽度に阻害され、K63結合のユビキチン化は健常者と比較して促進していた。さらにユビキチン化酵素であるLUBACの構成要素のタンパク発現が著名に低下していることが判明した。このことから、CYLDの質的欠損がLUBACの不安定性を引き起こし、M1結合ユビキチン化の減少をもたらす可能性が示唆された。②線維芽細胞を用いたNF-κBシグナル伝達の検討：フローサイトメトリーによる解析から、患者ではTNF-αによるNF-κB活性化が軽度に障害されることが明らかとなった。また、患者の線維芽細胞では、TNF-α刺激に対するIL-6 mRNAの発現が損なわれ、IL-6の分泌も障害されていた。よってCYLD欠損線維芽細胞においても、NF-κBシグナル伝達に異常があることが明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

患者は、免疫不全と症候学的特徴を併せ持つ。患者が示す臨床症状はCyldノックアウトマウスの表現型と類似するものの、これまでヒトにおいてはヘテロ接合性変異による皮膚腫瘍発症の報告があるのみで、患者で認めた複合ヘテロ変異による報告例はない。
CYLDは脱ユビキチン化酵素であり、NF-κBのシグナル伝達を負に制御することが知られている。ノックアウトマウスの表現型を参照しながら、患者でみとめるCYLD欠損の分子病態について解明することを目的とし研究を進めている。一過性強制発現系実験では、各アレルごとの発現、脱ユビキチン化能、NF-κBシグナル伝達能について検討してその障害を明らかにした。患者由来の末梢血・骨髄細胞を用いた解析からは、免疫系細胞の量的・質的異常を明らかにするとともに、破骨細胞の過形成による骨粗鬆症発症との関連性についても明らかにすることができた。また患者由来の線維芽細胞を用いた解析では、TNF-αに対する脱ユビキチン化能、NF-κBシグナル伝達能の詳細を調べるとともにNF-κBシグナル伝達関連分子や下流分子の動態をmRNAレベル、タンパクレベルで検証を行い、CYLDの欠損による分子病態の全貌が明らかになりつつある。したがって現在のところ、当初の計画通りにおおむね順調に研究が進展していると言える。

今後の研究の推進方策

健常者および患者由来の線維芽細胞を用いた網羅的RNA発現解析のデータ解析を行う。
現在、患者でみとめる変異を有したCyldのノックインマウスの作製中である。複合ヘテロ変異のアレル毎の機能評価を行うためのノックインホモマウスが得られ次第、免疫学的解析をはじめ、患者の表現型との比較検討をしながら評価する予定である。
また過去三年間の研究成果について総合的な評価を行い、再現実験が必要であれば施行し、論文化を進める。

次年度使用額が生じた理由

CYLD欠損症患者は世界において初症例である。第2症例目を探索しているが、現在1名のみしか存在しない。よって、本研究遂行のためには、より詳細な解析が必要と考えている。そこで、患者の変異を有したCyldノックインマウスの樹立を試みている。樹立したノックインマウスを用いて免疫学的検討をはじめ、骨粗鬆症などの表現型などこれまでに得た研究成果と比較検討を行う予定である。そのため、マウスの飼育費用、解析費用を次年度に持ち越すことにした。
また、論文化に向け、再現実験を行う必要があり、それらに必要な試薬等の購入のための経費も次年度に持ち越すことにした。

研究成果

• [雑誌論文] A complementary approach for genetic diagnosis of inborn errors of immunity using proteogenomic analysis (2023)
  • 著者名/発表者名: Sakura F, Noma K, Asano T, Tanita K, Toyofuku E, Kato K, Tsumura M, Nihira H, Izawa K, Mitsui-Sekinaka K, Konno R, Kawashima Y, Mizoguchi Y, Karakawa S, Hayakawa S, Kawaguchi H, Imai K, Nonoyama S, Yasumi T, Ohnishi H, Kanegane H, Ohara O, Okada S
  • 雑誌名: PNAS Nexus 巻: 2 ページ: 1～12
  • DOI: 10.1093/pnasnexus/pgad104
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Novel STAT1 Variants in Japanese Patients with Isolated Mendelian Susceptibility to Mycobacterial Diseases (2022)
  • 著者名/発表者名: Ono R, Tsumura M, Shima S, Matsuda Y, Gotoh K, Miyata Y, Yoto Y, Tomomasa D, Utsumi T, Ohnishi H, Kato Z, Ishiwada N, Ishikawa A, Wada T, Uhara H, Nishikomori R, Hasegawa D, Okada S, Kanegane H.
  • 雑誌名: Journal of Clinical Immunology 巻: 43 ページ: 466～478
  • DOI: 10.1007/s10875-022-01396-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Neutralizing Type I Interferon Autoantibodies in Japanese Patients with Severe COVID-19 (2022)
  • 著者名/発表者名: Eto S, Nukui Y, Tsumura M, Nakagama Y, Kashimada K, Mizoguchi Y, Utsumi T, Taniguchi M, Sakura F, Noma K, Yoshida Y, Ohshimo S, Nagashima S, Okamoto K, Endo A, Imai K, Kanegane H, Ohnishi H, Hirata S, Sugiyama E, Shime N, Ito M, Ohge H, Kido Y, Bastard P, Casanova JL, Ohara O, Tanaka J, Morio T, Okada S
  • 雑誌名: Journal of Clinical Immunology 巻: 42 ページ: 1360～1370
  • DOI: 10.1007/s10875-022-01308-3
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The risk of COVID-19 death is much greater and age dependent with type I IFN autoantibodies (2022)
  • 著者名/発表者名: Manry J, Bastard P, Gervais A, Le Voyer T, Rosain J, Philippot Q, Michailidis E, Hoffmann HH, Eto S,・・・, Tsumura M, et al
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 119 ページ: e2200413119
  • DOI: 10.1073/pnas.2200413119
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] COVID-19重症化とI型インターフェロン中和抗体の保有状況との関連性の検討 (2022)
  • 著者名/発表者名: 江藤 昌平、津村 弥来、永島 慎太郎、Paul Bastard、岡本 圭祐、鹿島田 健一、遠藤 明史、溝口 洋子、田中 純子、中釜 悠、城戸 康年、貫井 陽子、今井 耕輔、金兼 弘和、森尾 友宏、Casanova Jean-Laurent、岡田 賢
  • 学会等名: 第125回日本小児科学会学術集会
• [学会発表] Chronic mucocutaneous candidiasis disease due to a novel duplication mutation of IL17RC (2022)
  • 著者名/発表者名: Kosuke Noma, Miyuki Tsumura, Takaki Asano, Yoko Mizoguchi, Takayo Shoji, Satoshi Okada
  • 学会等名: 20th Biennial Meeting of the European Society for Immunodeficiencies
  • 国際学会
• [学会発表] 本邦におけるI型インターフェロンに対する自己抗体とCOVID-19重症化の関連性の検討 (2022)
  • 著者名/発表者名: 江藤昌平、津村弥来、永島慎太郎、Paul Bastard、岡本圭祐、鹿島田健一、遠藤明史、溝口洋子、田中純子、中釜 悠、城戸康年、貫井陽子、今井耕輔、金兼弘和、小原 收、森尾友宏、Jean-Laurent Casanova、岡田 賢
  • 学会等名: 第50回日本臨床免疫学会総会
• [学会発表] IL17RC新規重複変異による慢性粘膜皮膚カンジダ症 (2022)
  • 著者名/発表者名: 野間 康輔、津村 弥来、浅野 孝基、溝口 洋子、荘司 貴代、岡田 賢
  • 学会等名: 第6回日本免疫不全・自己炎症学会総会・学術集会
• [学会発表] 本邦初の常染色体顕性IL6ST 異常症の2症例の同定と分子病態の解明 (2022)
  • 著者名/発表者名: 芦原 康介、浅野 孝基、野間 康輔、津村 弥来、豊福 悦史、関根 朗雅、今井 耕輔、岡田 賢
  • 学会等名: 第6回日本免疫不全・自己炎症学会総会・学術集会