| 研究課題/領域番号 |
20K08166
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
神保 恵理子 (藤田恵理子) 自治医科大学, 医学部, 講師 (20291651)
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| 研究分担者 |
桃井 隆 東京医科大学, 医学部, 客員教授 (40143507)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | GPCR / 自閉症スペクトラム障害 / シグナル伝達 |
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| 研究実績の概要 |
自閉症スペクトラム障害の患者数は増加の一途を辿っている。原因として複数のシナプス関連遺伝子が報告されてきた。そして、シナプス機能形成に関わる神経接着-足場蛋白質-受容体の蛋白質複合体などに含まれる遺伝子の変異によるシナプス機能不全の可能性も示唆されている。しかしながら、複数の原因遺伝子やこれらの遺伝子をコードする蛋白質と、分子病態との関係は、依然として明らかでない。これまでに、我々は、複合体の構成成分で、G蛋白共役受容体(GPCR)である、GPR37と GPR85のそれぞれに(R558Q)変異と(M125T、V211L)変異を発見し、これら変異蛋白質による複合体形成の障害を検出した。本研究では、GPR85に焦点を当て、GPR85欠損、変異M125T導入マウスの細胞に導入し、シグナル伝達機構、変異による影響を明らかにすることを目的としている。
初年度である2020年度は、GPR85欠損、変異マウスを用いたGPR85シグナル伝達系の解析をするために、細胞や組織に導入するGPR85-アデノ随伴ウイルス(AAV)プラスミドベクターおよびコントロールベクターの構築と作製を行った。GPR85のリガンドが不明なことから、プラスミドベクターにはリガンド結合部位を含む細胞外側をチャネルロドプシン2と入れ替えた光感受性GPR85(正常)キメラ型を搭載し、光に応答したGPCRシグナル伝達経路の選択的な活性化の惹起によるリガンドの薬理効果を模擬的に検証可能にした。マウス個体への導入は、次年度に実施予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
哺乳細胞や組織に導入するGPR85-アデノ随伴ウイルス(AAV)プラスミドベクターの構築および作製をすることができた点は評価できる。また、どの細胞に遺伝子が導入されたかを1つの遺伝子が2種類のタンパク質をコードするbicistronicな方法で目印をつけ、哺乳細胞で確認できたことは良い。しかしながら、個体への導入まで至らなかったことから、やや遅延しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
・GPR85欠損、変異マウスを用いたGPR85シグナル伝達系の解析のために、キメラGPR85-AAVベクターの導入と、それに伴い変動する遺伝子と受容体の局在の解析；野生型、およびGPR85欠損、変異M125T導入マウスの脳、神経細胞にキメラGPR85(正常)を導入・発現させ、光感受性による活性化により、発現変動するRNA発現をマイクロアレイで比較解析する。
・遺伝子導入後のマウスの行動を解析する。
・GABA受容体、Serotonin受容体のmRNAのレベル変動を確認し、他の変動の大きい遺伝子についてもリアルタイムPCRで確認する。キメラGPR85発現させた領域や神経細胞でのGABA受容体およびSerotonin受容体の局在や発現量を免疫染色法により解析する。
・シグナル伝達経路の変動解析では、キメラGPR85を発現した脳領域および神経細胞について、シグナル伝達経路上のERKのリン酸化、IP3量などについて解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Covid-19の影響で、マウス飼育や実験に制約、また消耗品の入荷遅延などが生じ、解析が十分できなかったため。2021年度には遅延を取り戻し、主にマウスへの遺伝子導入および行動解析を進めていく予定である。
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