| 研究課題/領域番号 |
20K08170
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
竹内 大二 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (40328456)
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| 研究分担者 |
羽山 恵美子 東京女子医科大学, 医学部, 非常勤講師 (00349698)
古谷 喜幸 東京女子医科大学, 医学部, 研究生 (10424673)
中西 敏雄 東京女子医科大学, 医学部, 研究生 (90120013)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | SCN5A / 早期発症LQTS / 疾患iPS細胞 / 心筋細胞 |
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| 研究実績の概要 |
2020年度は、研究1「Nav1.5安定発現細胞を用い早期発症LQTS変異22種の電気生理学的解析」の実施のため、Nav1.5遺伝子の変異の作製を行った。野生型のSCN5A遺伝子に、PCRと変異プライマーを用いて目的の変異を導入し、シークエンスによる変異導入の確認を完了した哺乳類発現ベクター18種を作製した。これらの発現プラスミドをそれぞれ293T細胞に導入し、ハイグロマイシン選択により、変異クローンの作製を進めている。
研究２の「Nav1.5安定発現株に制御タンパク質を共発現し電気生理の変化を検討」に関しては、2020年度は、ヒトα1シントロフィン、カベオリン3、Kir2.1 のクローニングに成功し、いずれも塩基配列の確認まで進めることができた。
研究３の「R1623Q iPS細胞2検体由来iPS細胞を心筋細胞に分化し機能解析と生化学的分析を行う」に関しては、すでに健常者と1例目の患者のiPS細胞を保有していたが、2020年度はR1623Q変異2例目の患者からiPS細胞を作製することができた。Lian, Xらの方法（Nat Protoc 2013）に浮遊培養を一部導入するという改良を加え、iPS細胞をGSK3 阻害剤（CHIR99021）によりWntシグナルを活性化し中胚葉細胞へ誘導し、続いてWntシナル阻害剤により心筋細胞へ分化する実験を複数回実施した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究1 「Nav1.5安定発現細胞を用い早期発症LQTS変異22種の電気生理学的解析」に必要なNav1.5変異遺伝子発現プラスミドを2020年度は18種類作製した。目標の22変異を詳細に検討したところ、4変異はNav1.5のアミノ酸配列ではありえないことが判明したので、実質すべてのターゲット変異の作製を完了した。2020年度はこれらの18種の変異を含む発現プラスミドを293T細胞に導入し、クローニングを開始するところまで到達できた。
研究２の「Nav1.5安定発現株に制御タンパク質を共発現し電気生理の変化を検討」を実施するために、制御遺伝子候補であるNaチャネルβサブユニット1～4は本研究開始時にクローニング済であった。2020年度は、残りのα1シントロフィン、カベオリン3、Kir2.1 の塩基配列の確認を含むクローニングを完了した。
研究3の「R1623Q iPS細胞2検体由来iPS細胞を心筋細胞に分化し機能解析と生化学的分析を行う」に関しては、これまでに健常者とR1623Q変異をもつ患者2例のiPS細胞の作製を完了した。これらのiPS細胞の心筋細胞への分化誘導法を、心筋小塊を形成する方法を加えることにより、心筋特異的な遺伝子の発現の改良を行った。これらのiPS細胞由来分化心筋細胞を用い、電気生理学的実験を進めている。本研究に必要なiPS細胞をすべて得ており、心筋分化法の部分改善が進み、健常者と疾患モデル心筋との比較データを取得し始めていることから、概ね順調な進捗状況と考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究1の「Nav1.5安定発現細胞を用い早期発症LQTS変異22種の電気生理学的解析」の推進のために、2021年度は、293T細胞Nav1.5変異安定発現株の作製を続行し完成させる。これらの細胞を用いて、オートパッチクランプ法によるNa電流の測定を進めることにより、野生型と変異型のNav1.5の違いを電気生理学的に明らかにする。
研究２の「Nav1.5安定発現株に制御タンパク質を共発現し電気生理の変化を検討」の推進のために、2021年度は、Naチャネルβサブユニット1～4、α1シントロフィン、カベオリン3、Kir2.1の制御候補遺伝子を、ピューロマイシン選択型哺乳類発現ベクター及び2遺伝子を共発現できるpIRES哺乳類細胞発現ベクターにサブクローニングし、Nav1.5と共発現するHEK293細胞の構築を進める。
研究3の「R1623Q iPS細胞2検体由来iPS細胞を心筋細胞に分化し機能解析と生化学的分析を行う」のために、健常者複数とR1623Q変異2名のiPS細胞由来分化心筋細胞（2次元分化型と心筋塊型）を用い、マルチ電極アレーシステム（MED64システム）を用いた電気生理学的特性の解析を行う。心電図のQT 間隔に該当する細胞外電位や拍動頻度を計測し、チャネルの変異によるQT 間隔延長などの評価を行う。薬理学的研究にもMED64 システムを用い、分化心筋細胞に様々なβ遮断薬・Na 遮断薬を種々の濃度で添加し細胞外電位等を測定し、その効果から患者に有効な治療薬の選択のための資料とする。
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