| 研究課題/領域番号 |
20K08185
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| 研究機関 | 福島県立医科大学 |
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研究代表者 |
細矢 光亮 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (80192318)
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| 研究分担者 |
橋本 浩一 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (50322342)
佐藤 晶論 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (60423795)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ウイルス関連急性脳症 / 脳症 / 解熱消炎鎮痛剤 / 細胞透過性 / 血液脳関門 / タイトジャンクション |
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| 研究実績の概要 |
ウイルス関連急性脳症（VAE）は、インフルエンザウイルスやヒトヘルペスウイルス、RSウイルス、ロタウイルスなどの一般的なウイルス感染後に発症する重篤な合併症の一つであり、急激な意識障害や痙攣を伴う。現在VAEは高サイトカイン血症により脳内深部の血管透過性が亢進し、血管周囲へ血液成分が漏出することで、血管周囲の脳組織が浮腫に陥り、二次的に神経細胞やグリア細胞がアポトーシスに陥ると考えられているがその詳細は不明である。
本研究ではヒト脳血管内皮細胞を用いてin vitro 3次元VAEモデルを作成し、血管透過性の動的、質的変化を解明することで、ウイルス性脳症の血管内皮細胞障害に対する有効な治療戦略を検討しようとするものである。これにより、各種サイトカイン、薬剤の血管透過性への影響、さらにタイトジャンクションへの作用が明らかになり、ウイルス性脳症に対する詳細な病態解明、有効な治療法の確立につながると予想される。
本年度は、専用プレート（transwell）のインサートの下側にヒト脳血管周皮細胞、インサート上側にヒト脳血管内皮細胞（HBMECs）をそれぞれ単層培養し、血液脳関門（BBB）再現３次元モデルを作成した。培養細胞はcellZscopeを用い経内皮細胞電気抵抗(TER)を経時的に測定し、タイト結合の形成（TERが上昇しプラトーになった段階）を確認した後、培養液中にTNF-alphaを添加し、ウイルス関連急性脳症（VAE）モデルを作成した。VAEモデルに非ステロイド性抗炎症剤（NASIDS）を添加しTERを経時的に測定し、細胞透過性の変化を記録した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の基本となる実験系である、ヒト脳血管周皮細胞とヒト脳血管内皮細胞の3次元培養により血液脳関門再現３次元モデルの作成し、さらにTNF-alphaを添加によるウイルス関連急性脳症モデルを確立した。さらに、VAEモデルにVAE増悪因子とされている非ステロイド性抗炎症剤（NSAIDs）を添加し、経内皮電気抵抗値（TER）の測定、溶質透過性試験により傍細胞透過性への影響を検討した。
VAEモデルにNSAIDsの一つであるメフェナム酸100uMを添加すると、TNF-α非存在下と比較して、TNF-α 1ng/ml存在下では有意に透過性が亢進した。さらに、この透過性の亢進が血管内皮細胞のアポトーシスによるものか検討するために、細胞障害性についても追加検討した。ヒト脳血管内皮細胞を単層培養し、そこへTNF-αとNSAIDsを添加し、cell couting kit-8、cytotoxity LDH assay kitを用いて細胞障害性を検討したが、TNF-α、NSAIDsによる明らかな細胞障害は認められなかった。
以上より、今年度の目標としていた、VAEモデルの動的評価、機能的評価を概ね行うことができ、細胞障害性についても検討できたため、概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ウイルス関連急性脳症モデルを用い、添加するサイトカインやNSAIDsの種類を増やし、より詳細に細胞透過性への影響をTERの経時的な測定により動的に評価する。並行してFITC標識デキストランを用いた溶質透過性試験により、血管透過性を機能的に評価する。さらに、血管透過性に関連するタイト結合構成蛋白を免疫染色、分子生物学的解析により発現、局在について評価する。
また、VAE治療薬として期待される、ステロイド剤などの免疫抑制剤、抗サイトカイン抗体、抗アポトーシス薬、またはタイト結合の形成を促進させ血管透過性を改善させうる薬剤（cyclic AMP、フォスフォジエステラーゼ阻害剤、エストロゲン）などが透過性の改善につながるか検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
COVID19の影響で輸入品の一部の消耗品の購入ができなかったため次年度使用額が生じた。
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