| 研究課題/領域番号 |
20K08188
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
古川 泰三 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20515291)
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| 研究分担者 |
松田 修 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00271164)
岸田 綱郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00370205)
東 真弓 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10380453)
馬庭 淳之介 国立研究開発法人国立がん研究センター, 中央病院, 医員 (20847222)
坂井 宏平 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30515292)
田尻 達郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80304806)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 間葉系幹細胞 / エクソソーム / 先天性横隔膜ヘルニア / 羊水腔投与 / ラット |
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| 研究実績の概要 |
先天性横隔膜ヘルニア(CDH)には近年，新生児呼吸管理の進歩より救命率は目覚ましく改善している.一方、極度の肺低形を伴う最重症例においては根治手術に到達以前に失っている現状があり,胎児期における肺成熟を促す治療方法が希求されている.我々はこれまでにCDHに対する新規胎児治療の開発に向け,ニトロフェンCDHモデルラットを用いて間葉系幹細胞(MSC)を羊水腔投与することにより,CDH胎仔において肺成熟が促されることを報告した.次の段階として, MSCの作用機序を解明するためMSCが分泌するエクソソーム（MSC-エクソソーム）の効果を検討する．また，MSC-エクソソームに含有されている代表的なgrowth factorの肺成熟に与える影響を比較検討し， MSCが肺成熟を促すメカニズムの解明を目指す.
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
コラーゲン膜の表面または裏面にMSC 10,000/平方センチメートル播種し，MSC培養培地で一晩培養する．培地を無血清のDMEM/F-12培地に入れ替え，正常妊娠SDラットまたはニトロフェン投与妊娠SDラットより胎生13.5日目または胎生14.5日目胎仔を摘出し，胎仔より肺芽を採取して，コラーゲン膜上で気液界面培養を72時間行った．24時間毎に肺芽の状態を評価し，凍結保存する．MSCがない培養群をControl群，MSCと接着した状態の培養群をCo-culture群，MSCと非接触状態の培養群をSeparate-culture群とした．組織学的評価として肺芽の表面積と終末肺芽数の増加率を比較検討した．正常妊娠SDラット胎仔（胎生13.5日目または胎生14.5日目）由来の肺芽培養ではContorol群とCo-culture群より摘出した肺芽の培養では表面積の増加率で有意差を認めたが，Separate-culture群に関しては有意差を認めなかった．ニトロフェン投与妊娠SDラットに関しても並行して同様の実験系を行い，評価を行なったが，有意な結果は得られなかった．先行論文よりMSC培養上清を用いた肺芽培養で成長率の増加を報告していることから，培養法の再検討が必要考えられる．
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| 今後の研究の推進方策 |
肺芽培養の検討内容としては，MSCの培養条件の改善を検討している．MSC-エクソソームによる肺芽成長への影響を検討するため，肺芽培養時に無血清培地に入れ替えていたが，無血清培地ではMSCの生存には過酷な条件であることから血清を含む培地への変更を検討している．また，肺芽培養する前にMSCを数日培養することで培地中MSC-エクソソームの濃度に差ができ，肺芽成長に影響を及ぼす可能性があることを考慮して最適培養日数を検討している．
組織学的評価で有意差を得られる培養条件を決定した後，培養肺芽中のgrowth factor（FGF-10，FGF-9，Wnt7b，BMP4，SHH ，VEGF-α）の発現をRT-PCRで評価する．また，Western BlottingやELISA法により肺芽培養の培養上清中のMSC-エクソソームのgrowth factorのタンパク解析検討している．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
separate-culture群で有意差を認めなかったため，その検証をするため培養肺芽中のgrowth factorを調べる工程に進めず，FGF-10，FGF-9，Wnt7b，BMP4，SHH ，VEGF-αの抗体を購入することがなかったため消耗品の使用量が少なくなった．しかし，令和３年度はこれら増殖因子の抗体を大量に購入する必要があり当初の予定より消耗品が増加する見込みである
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