| 研究課題/領域番号 |
20K08218
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
横山 和明 帝京大学, 薬学部, 教授 (50246021)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ペルオキシソーム病 / 先天代謝異常症 / 副腎白質ジストロフィー / 脂質メタボローム / リピドミクス / スフィンゴ糖脂質の網羅的解析 / リン脂質の網羅的解析 / 質量イメージング |
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| 研究実績の概要 |
副腎白質ジストロフィー(adrenoleukodystrophy; ALD)はペルオキシソーム病に分類される先天代謝異常疾患である。生体内で炭素数が22を超える極長鎖脂肪酸は、ミトコンドリアでなくペルオキシソームでβ酸化されることにより、過剰量が除去されている。しかし本疾患では極長鎖脂肪酸をペルオキシソーム内に輸送する膜タンパクATP-binding cassette transporter D1 (ABCD1)の変異により、極長鎖脂肪酸が輸送されず分解されないため体内に蓄積する。主たる症状は脳神経系での後天的な炎症性脱髄とそれに伴う神経精神症状であり、副腎の機能不全も伴う。蓄積した極長鎖脂肪酸およびそれを含有する複合脂質分子と発症の因果関係が指摘されているものの、機序は解明されていない。本研究はALDの臨床サンプルで見出した、特異なスフィンゴ糖脂質分子およびリン脂質分子が、本疾患の後天的な発症を規定する因子なのではないか、という問いを明らかにするものである。前者は独自開発の解析系で見出した新奇スフィンゴ糖脂質で、その構造を質量分析計を用いて明らかにし、質量イメージングにより発現分布を解析する。後者は極長鎖脂肪酸をグリセロール１位に結合するリン脂質である。その合成酵素の候補であるアシル基転移酵素について、本疾患のモデル細胞でゲノム編集法を用いて解析し、明らかにする。さらにこの合成酵素は創薬ターゲットでもあるため、化合物ライブラリーを用いて阻害薬を探索する。さらに新奇スフィンゴ糖脂質および極長鎖脂肪酸含有リン脂質の両脂質分子に対する抗体が、未発症者にはなく発症患者の血液中にあるかを解析する。これによりこれら脂質分子が発症に寄与する分子であるかを明らかにし、発症機構を解明するとともに、発症の診断マーカーとしての展開を図る。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
（A）新奇スフィンゴ糖脂質に関する解析：(1)液体クロマトグラフィー－質量分析計(LC-MS)を用いたスフィンゴ糖脂質網羅的一斉解析法により、ヒトALDの剖検脳で、マウスの脳には見られない新規シグナル群の発現分布について、線維芽細胞、血漿、ろ紙血に関して解析した。その結果患者と健常者のサンプルいずれからもシグナルは検出されなかった。一方、既知のスフィンゴ糖脂質で極長鎖脂肪酸を含有する分子種群を検出した。(2)新奇分子種については、存在量が非常に微量であることとから通常のLC-MS法では構造解析できなかった。オービトラップ型質量分析計にナノフローイオン源を介してTriversa NanoMateを接続し、フラクションコレクター機能により分画したのちに持続的微量注入と超高精密質量測定による構造決定系の構築を進めている。これまでにマウス脳の微量なスフィンゴ糖脂質の構造解析が可能であることを確認した。
（B）極長鎖脂肪酸含有リン脂質に関する解析：(1)ALD で蓄積する極長鎖脂肪酸含有リン脂質の生合成系については、患者細胞と同様に極長鎖脂肪酸含有リン脂質が蓄積するALDモデル細胞であるABCD1欠損細胞に対して、CRISPR/Cas9ゲノム編集法より欠損させるとこの蓄積が解消し、再発限すると蓄積が回復するアシルトランスフェラーゼを見出した。遺伝子工学的に発現させた本酵素の基質特異性を検討中であり、予備的な結果としてある極長鎖脂肪酸は好適な基質であることを確認した。(2) 極長鎖脂肪酸含有リン脂質の病原性を解析するため、ヒトALDの剖検脳において、質量イメージングの手法により局在部位を解析中である。(3)当初計画に加えてALD発症患者血漿に存在し、健常者や女性保因者には存在しないリン脂質分子種群のシグナルを見い出した。これら分子種は発症の診断マーカーとなりうる可能性が考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
（A）新奇スフィンゴ糖脂質に関する解析：ALD患者の脳に特徴的なスフィンゴ糖脂質分子種であると考えらるため、速やかに構造を決定する。これにより決定する精密質量を元に質量イメージングを行い、剖検脳サンプル中での局在を明らかとする。さらに本脂質に対する抗体の存在について患者血清を用いて解析する。また患者線維芽細胞や血漿・ろ紙血サンプルにおいて検出された既知のスフィンゴ糖脂質で極長鎖脂肪酸を含有する分子種群についても同様に解析する。
（B）極長鎖脂肪酸含有リン脂質に関する解析：見出したアシルトランスフェラーゼが極長鎖脂肪酸含有リン脂質の合成酵素であるかについて、酵素の性状をさらに解析して明らかとする。これが明らかにされたのち、化合物ライブラリーを用いて、酵素素材材の探索を行い治療薬の可能性を探る。また発症したALD患者の血漿で見出されたリン脂質分子種群については、さらに患者とともに未発症者や保因者での解析数を増やし、発症の診断マーカーとなるかについてさらに検討する。この分子種群や極長鎖脂肪酸含有リン脂質に対する抗体の存在について患者血清を用いて解析するとともに、質量イメージングを行い、剖検脳サンプル中での局在を明らかとする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実施計画から一部遅れている部分があり、次年度に行うためその支出も次年度になった。
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