人工知能(AI)とRNA-Seqの融合による遺伝性小児神経疾患の新たな病因解明

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K08236
• 研究機関: 昭和大学
• 研究代表者: 加藤 光広 昭和大学, 医学部, 教授 (10292434)
• 研究分担者: 宮 冬樹 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (50415311) ; 中村 和幸 山形大学, 医学部, 助教 (20436215)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: 人工知能 / スプライス異常 / RT-PCR / エクソーム解析 / RNA-Seq

研究実績の概要

小児期発症の希少難治性神経疾患は遺伝性が高い。私たちは1000家系以上でエクソーム解析を行い、多数の原因遺伝子を明らかにしてきたが、全ゲノム解析でも原因同定率は60%程度であり、新たな解析方法の開発が求められている。エクソーム解析では原因が不明であった脳形成異常例に、人工知能(AI)技術を用いたスプライス部位の予測アルゴリズムSpliceAIを用いて解析したところ、劣性遺伝の小頭症3家系6名に共通するスプライス変異を同定した。同定した変異部位はエクソンから40塩基対以上離れたイントロンに存在し、従来のスプライス部位予測アルゴリズムでは検出できていなかった。その後、株化リンパ球を用いた発現実験を行い、RT-PCRで正常とは異なる長さの転写産物を認め、スプライス異常を確認した。スプライス異常検出におけるAI技術の有用性を確認した。SpliceAIのアルゴリズムをエクソームデータの解析プラットフォームに組み込み、新規にエクソーム解析を行った発端者295例＋家族193検体の計488検体についてスプライス異常の検出を試みた。その結果、発端者50例でスプライス異常が予測された。多くは親由来で病原性は否定的であったが、7例で疾患原因と考えられるde novoのスプライス異常が予測される変異を認めた。うち2例はSpliceAIのスコアは低かったが、ACMGガイドラインではpathogenicと判定された。1例で株化リンパ球を用いた発現実験を計画し、RNA-Seq解析では株化リンパ球での発現がなかったため、強制発現実験のための細胞培養を進めている。また、SpliceAIでスコアの低かった1例に対し、RT-PCRを行ったところスプライス異常は示されず、SpliceAIの予測通りであった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

株化リンパ球を用いた発現実験を行い、RT-PCRで正常とは異なる長さの転写産物を認め、スプライス異常を確認し、スプライス異常検出におけるAI技術の有用性を確認した。SpliceAIのアルゴリズムをエクソームデータの解析プラットフォームに組み込み、新規にエクソーム解析を行った発端者295例＋家族193検体の計488検体についてスプライス異常の検出を試みた。その結果、発端者50例でスプライス異常が予測された。多くは親由来で病原性は否定的であったが、7例で疾患原因と考えられるde novoのスプライス異常を認めた。うち2例はSpliceAIのスコアは低かったが、ACMGガイドラインではpathogenicと判定された。遺伝子Xの株化リンパ球を用いた発現実験を計画したが、遺伝子Xは、RNA-Seq解析では株化リンパ球での発現がなかった。株化リンパ球をゲノム編集し遺伝子Xを強制発現させる実験計画を追加し、倫理審査で承認された。現在、リンパ芽球の細胞培養を進めている。SpliceAIでスコアの低かった1例に対し、血液から抽出したRNAを用いてRT-PCRを行いスプライス異常の有無を検討した。スプライス異常を示すバンドは得られず、SpliceAIの予測通り、スプライス異常ではなく、アミノ酸置換によるタンパク質の機能異常が考えられた。毛根組織などを用いたRNA-Seq解析に関しては進捗が遅延している。RNA解析関連の試薬を用いたコントロール検体での検討やリンパ芽球樹立の準備が遅れていることが要因である。

今後の研究の推進方策

引き続き、エクソーム解析データのSpliceAIによるスプライス異常の検出と病原性の確認を進める。検出されたスプライス異常については、株化リンパ球を用いて、RT-PCRを行い転写産物の長さを調べ、スプライス異常が起きているかどうかを確認する。遺伝子Xでは株化リンパ球での発現がなかったため、ゲノム編集による強制発現を行い、スプライス異常を確認する。毛根による発現解析を進める。トリオエクソーム解析で原因が同定されなかった症例について、RNA-Seqの解析を進める。コントロール検体として毛根・脳組織・リンパ芽球からRNA抽出を行いRNA-Seq解析を行いデータの質の確認を行う。疾患検体（毛根・リンパ芽球）におけるRNA-Seqへ進み、DNAの変異と関連したRNA発現の解析をまとめる。

次年度使用額が生じた理由

コントロール検体での検討やリンパ芽球樹立の準備が遅れており、その後に行われるRNA-Seqの費用が本年度少なかった。今年度の繰越額で次年度にRNA-Seqを行う。

研究成果

• [雑誌論文] Identification of two novel de novo TUBB variants in cases with brain malformations: case reports and literature review (2021)
  • 著者名/発表者名: Watanabe Kazuki、Nakashima Mitsuko、Kumada Satoko、Mashimo Hideaki、Enokizono Mikako、Yamada Keitaro、Kato Mitsuhiro、Saitsu Hirotomo
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: 66 ページ: 1193～1197
  • DOI: 10.1038/s10038-021-00956-4
• [雑誌論文] Epileptic encephalopathy patients with <i>SCN2A</i> variant initiated by neonatal seizure (2021)
  • 著者名/発表者名: Morichi Shinichiro、Ishida Yu、Yamanaka Gaku、Kato Mitsuhiro、Kawashima Hisashi
  • 雑誌名: Pediatrics International 巻: 63 ページ: 971～972
  • DOI: 10.1111/ped.14509
• [雑誌論文] Clinical variations of epileptic syndrome associated with PACS2 variant (2021)
  • 著者名/発表者名: Mizuno Tomoko、Miyata Rie、Hojo Akira、Tamura Yumie、Nakashima Mitsuko、Mizuguchi Takeshi、Matsumoto Naomichi、Kato Mitsuhiro
  • 雑誌名: Brain and Development 巻: 43 ページ: 343～347
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2020.10.006
• [雑誌論文] Complete sequencing of expanded <i>SAMD12</i> repeats by long-read sequencing and Cas9-mediated enrichment (2021)
  • 著者名/発表者名: Mizuguchi T, Toyota T, Miyatake S, Mitsuhashi S, Doi H, Kudo Y, Kishida H, Hayashi N, Tsuburaya RS, Kinoshita M, Fukuyama T, Fukuda H, Koshimizu E, Tsuchida N, Uchiyama Y, Fujita A, Takata A, Miyake N, Kato M, Tanaka F, Adachi H, Matsumoto N
  • 雑誌名: Brain 巻: 144 ページ: 1103～1117
  • DOI: 10.1093/brain/awab021
• [雑誌論文] De novo ATP1A3 variants cause polymicrogyria (2021)
  • 著者名/発表者名: Miyatake S, Kato M, Kumamoto T, Miya F, Tsunoda T, Togawa M, Saitsu H, Ohtaka-Maruyama C, Matsumoto N, et al.
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 7 ページ: 1~17
  • DOI: 10.1126/sciadv.abd2368
• [雑誌論文] A boy with biallelic frameshift variants in TTC5 and brain malformation resembling tubulinopathies (2021)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto Sachiko、Kato Mitsuhiro、Sugiyama Kenji、Horiguchi Ryo、Nakashima Mitsuko、Aoto Kazushi、Mutoh Hiroki、Saitsu Hirotomo
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: 66 ページ: 1189～1192
  • DOI: 10.1038/s10038-021-00953-7
• [雑誌論文] Comprehensive genetic analysis confers high diagnostic yield in 16 Japanese patients with corpus callosum anomalies (2021)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto S, Kato M, Hiraide T, Shiohama T, Goto T, Hojo A, Ebata A, Suzuki M, Kobayashi K, Chong PF, Kira R, Matsushita HB, Ikeda H, Hoshino K, Matsufuji M, Moriyama N, Furuyama M, Yamamoto T, Nakashima M, Saitsu H
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: 66 ページ: 1061～1068
  • DOI: 10.1038/s10038-021-00932-y
• [雑誌論文] Two cases of DYNC1H1 mutations with intractable epilepsy (2021)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto Ayumi、Kojima Karin、Miya Fuyuki、Miyauchi Akihiko、Watanabe Kazuhisa、Iwamoto Sadahiko、Kawai Kensuke、Kato Mitsuhiro、Takahashi Yukitoshi、Yamagata Takanori
  • 雑誌名: Brain and Development 巻: 43 ページ: 857～862
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2021.05.005
• [雑誌論文] Expanding the <scp> <i>KIF4A</i> </scp> ‐associated phenotype (2021)
  • 著者名/発表者名: Kalantari S, Carlston C, Alsaleh N, Abdel-Salam GMH, Alkuraya F, Kato M, Matsumoto N, Miyatake S, Yamamoto T, Fares-Taie L, Rozet JM, Chassaing N, Vincent-Delorme C, Kang-Bellin A, McWalter K, Bupp C, Palen E, Wagner MD, Niceta M, Cesario C, Milone R, Kaplan J, Wadman E, Dobyns WB, Filges I
  • 雑誌名: American Journal of Medical Genetics Part A 巻: 185 ページ: 3728～3739
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.62443
• [雑誌論文] Variants in <scp> <i>KIF2A</i> </scp> cause broad clinical presentation; the computational structural analysis of a novel variant in a patient with a cortical dysplasia, complex, with other brain malformations 3 (2021)
  • 著者名/発表者名: Hatano Maiko、Fukushima Hiroko、Ohto Tatsuyuki、Ueno Yuichi、Saeki Saki、Enokizono Takashi、Tanaka Ryuta、Tanaka Mai、Imagawa Kazuo、Kanai Yu、Kato Mitsuhiro、Shiraku Hiroshi、Suzuki Hisato、Uehara Tomoko、Takenouchi Toshiki、Kosaki Kenjiro、Takada Hidetoshi
  • 雑誌名: American Journal of Medical Genetics Part A 巻: 185 ページ: 1113～1119
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.62084
• [雑誌論文] Monoallelic and bi-allelic variants in NCDN cause neurodevelopmental delay, intellectual disability, and epilepsy (2021)
  • 著者名/発表者名: Fatima A, Hoeber J, Schuster J, Koshimizu E, Maya-Gonzalez C, Keren B, Mignot C, Akram T, Ali Z, Miyatake S, Tanigawa J, Koike T, Kato M, Murakami Y, Abdullah U, Ali MA, Fadoul R, Laan L, Castillejo-Lopez C, Liik M, Jin Z, Birnir B, Matsumoto N, Baig SM, Klar J, Dahl N
  • 雑誌名: The American Journal of Human Genetics 巻: 108 ページ: 739～748
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2021.02.015
• [雑誌論文] Mutation-specific pathophysiological mechanisms define different neurodevelopmental disorders associated with SATB1 dysfunction (2021)
  • 著者名/発表者名: den Hoed J, de Boer E, Voisin N, Dingemans AJM, Guex N, Wiel L, Chew HB, Chrast J, Cimbalistiene L, Hachiya Y, Abedi YH, Hanebeck J, Hehir-Kwa JY, Horist B, Itai T, Jackson A, Jewell R, Jones KL, Joss S, Kashii H, Kato M, et al.
  • 雑誌名: The American Journal of Human Genetics 巻: 108 ページ: 346～356
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2021.01.007
• [雑誌論文] ATP6V0A1 encoding the a1-subunit of the V0 domain of vacuolar H+-ATPases is essential for brain development in humans and mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Aoto K, Kato M, Akita T, Nakashima M, Mutoh H, Akasaka N, Tohyama J, Nomura Y, Hoshino K, Ago Y, Tanaka R, Epstein O, Ben-Haim R, Heyman E, Miyazaki T, Belal H, Takabayashi S, Ohba C, Takata A, Mizuguchi T, Miyatake S, Miyake N, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 12 ページ: 1~17
  • DOI: 10.1038/s41467-021-22389-5